MiR-24對肺癌A549細胞增殖和遷移的影響

杜娟，嚴馨，邱麗，易靜葉，陽甜

(西安交通大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安 710061)

肺癌是世界范圍內發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤疾病[1]，截止2013年我國的肺癌發生率和病死率均居惡性腫瘤首位，嚴重威脅人類的生命健康[2]。其中，非小細胞肺癌作為肺癌的常見亞型，約占所有病例的85%，傳統的化療藥物雖然可有效延長患者的生存期，但治療副作用較大，嚴重時還會危及患者生命[3-4]。微小核糖核酸24(micro ribonucleic acid 24，MiR-24等微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)作為機體內的癌基因或抑癌基因，可通過抑制細胞因子的表達調控細胞的凋亡和分化過程，進而影響宮頸癌、膽管癌等多種惡性腫瘤疾病的發生和進展[5-7]。異常表達的MiR-24在惡性腫瘤疾病的發生和發展過程中發揮出了“致癌”或“抑癌的作用”，甚至在惡性腫瘤疾病的放化療治療中也發揮出了一定的作用。然而，臨床中針對其在肺癌細胞中的影響研究卻相對較少，且其作用機制尚不明確。本研究分析MiR-24對肺癌A549細胞增殖和遷移的影響，并探討其作用機制，期望為肺癌的靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肺癌A549細胞購于中國科學院細胞庫；細胞培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清 [賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，臺盼藍染色檢測試劑盒(上海碧云天)，噻唑藍 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT](上海碧云天)，兔抗基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)(美國Abcam公司)，兔抗基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)(美國Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(美國Abcam公司)，TUNEL染色試劑盒(上海碧云天)，青霉素/鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)，MiR-24擬似物(CATGAGGGCAGAAACCGATGCAA)和MiR-24抑制物(GTTGCATCGGTTTCTGCCCTCATG)由廣州銳博生物有限公司合成，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海碧云天)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(上海碧云天)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 將人肺癌細胞A549放入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的雙抗細胞培養基中，并將其放置于5% CO2、37 ℃的細胞培養箱(山東博科生物產業有限公司，QP-50)內培養，待細胞長滿約90%時進行傳代，培養后取對數生長的細胞用于實驗。將加入MiR-24擬似物的細胞作為觀察組，加入MiR-24抑制物的細胞作為抑制組，另設空白對照作為對照組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖能力 將人肺癌A549細胞接種于1×104/孔的96孔板(賽默飛世爾科技有限公司)內，12 h后分別轉染MiR-24擬似物和抑制物，分別作為觀察組和抑制組，另設空白對照組，并在處理后分別于0、12、24和48 h各個不同時間段分別加入MTT，于37 ℃條件下孵育4 h，隨后加入100 μL DMSO，震蕩15 min后于490 nm處測量吸光值(optical density，OD)，以反映細胞增殖活力。OD490值越高，細胞的活力越高。平行試驗3次。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將處理后的人肺癌A549細胞接種于6孔板內，每孔3 mL，待細胞生長至90%融合后使用200 μL的吸頭在孔板內垂直劃痕，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對清洗3次后，將A549細胞分為3組，分別加入無血清培養基(對照組)、MiR-24擬似物(觀察組)和抑制物(抑制組)繼續培養，每組設立2個復孔，培養時間均為24 h。分別于實驗0 h和24 h于光學顯微鏡下觀察劃痕傷口的寬度并做好記錄，計算創面的愈合率作為細胞遷移能力的判定依據。創面愈合率=(1-24 h創面寬度/0 h創面寬度)×100%[8]。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 將對數生長的人肺癌A549細胞接種于Transwell小室中，每孔密度為1×105，終體積為200 μL，將600 μL的無血清培養基加入至下室內，待12 h后更換培養基，將A549細胞分為3組，分別加入無血清培養基(對照組)、MiR-24擬似物(觀察組)和抑制物(抑制組)繼續培養，每組設立2個復孔。轉染24 h后，使用棉簽將上層細胞擦去，使用濃度為95%的乙醇溶液固定20 min后，使用4%的臺盼藍染色20 min，于200倍的顯微鏡下觀察實驗結果，每個小室隨機抽取6個視野拍照并計算穿膜細胞個數。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達水平 細胞處理24 h后進行收集，裂解后再次收集細胞總蛋白，取等量的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將其轉印至聚偏氟乙烯(poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF)膜上，使用含有5%脫脂奶粉的封閉液將其封閉60 min，隨后加入兔抗MMP-2(1∶2 000)、兔抗MMP-9(1∶4 000)和鼠抗β-actin(1∶8 000)，于4 ℃的條件下反應8 h，使用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶10 000)于室溫條件下反應60 min，以GAPDH作為內參照，使用凝膠分析軟件進行分析，觀察內參泳道灰度及目的條帶之間的比值作為蛋白相對表達水平。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)檢測相關mRNA表達 利用qPCR法針對人肺癌A549細胞中的MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平進行檢測，采用TRizol法提取細胞總RNA后進行逆轉錄反應，反應條件為：37 ℃條件下反應15 min，98 ℃條件下反應5 min，反應結束后將cDNA稀釋至5倍，放置于-20 ℃的條件下保存，隨后使用檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)配置反應體系并在PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)上進行反應，反應條件為：95 ℃條件下15 min，95 ℃條件下10 s，62 ℃條件下10 s，共計反應40個循環后，使用儀器自帶的程序分析溶解曲線。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MiR-24對肺癌A549細胞增殖的影響

0 h時，觀察組和抑制組的OD490值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；在12、24和48 h，觀察組的OD490值低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 MiR-24對肺癌A549細胞增殖的影響

2.2 MiR-24對肺癌A549細胞遷移和侵襲的影響

單因素ANOVA分析結果顯示，各組間的遷移細胞數、侵襲細胞數和愈合率比較，觀察組<對照組<抑制組，且組間三項指標比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1和圖2。

2.3 MiR-24對肺癌A549細胞相關蛋白表達的影響

單因素ANOVA分析結果顯示，MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較，觀察組<對照組<抑制組，組間兩項指標比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3和圖3。

表2 MiR-24對肺癌A549細胞遷移和侵襲的影響

表3 MiR-24對肺癌A549細胞相關蛋白表達的影響

2.4 MiR-24對肺癌A549細胞相關mRNA表達的影響

單因素ANOVA分析結果顯示，MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平比較，觀察組<對照組<抑制組，組間兩項指標比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 MiR-24對肺癌A549細胞相關mRNA表達的影響

3 討論

肺癌是目前導致癌癥相關性死亡的常見病因，每年有180萬的肺癌新發病例，且有160萬人因肺癌死亡[9]，而肺癌患者的5年生存率僅有4%～17%[10]。臨床中，針對肺癌患者的治療方式包括手術治療、藥物治療和放射干預治療等，隨著近年來臨床治療水平的不斷提升，各種治療方式雖取得了一定的進步，但肺癌患者的遠期生存率仍相對較低，因此迫切需要一種更加有效的治療手段[11]。近年來，大量臨床研究[12-15]發現miRNA廣泛存在于人體的體液、組織以及血液當中，在腫瘤的發生、發展以及預后中至關重要，由于其可在血清中穩定存在，且具有一定的重復性，因此在臨床中有較好的應用價值[12]。譬如，MiR-21、MiR-34和MiR-23等多種miRNA均在肺癌組織中存在明顯的表達異常，對肺癌的發生和發展有重要作用[13-15]。

MiR-24在人體多種組織內廣泛存在，可調控細胞的生長發育和增殖、凋亡，但其在不同細胞內對細胞的增殖和凋亡調控作用卻并不相同[16-17]。本研究發現觀察組在12 h、24 h和48 h的細胞增殖率低于抑制組(P<0.05)，觀察組的遷移細胞數、侵襲細胞數和愈合率均低于對照組和抑制組(P<0.05)，且對照組低于抑制組(P<0.05)，說明MiR-24過表達可有效抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與既往研究[18]結果相似。

MMP是一種內肽酶，可降解大部分的細胞外基質成分，具有促進腫瘤細胞突破組織屏障，侵襲鄰近組織的能力[19]。MMP-2和MMP-9在許多腫瘤組織中均有所表達，不僅影響腫瘤細胞的組織屏障及其侵襲鄰近組織的能力，且對腫瘤細胞的黏附能力也可以產生一定的作用[20]。本研究發現，MMP-2、MMP-9蛋白以及兩者mRNA的表達比較，觀察組>對照組>抑制組(P<0.05)，提示MiR-24可能通過對MMP-2和MMP-9表達水平的調控，進而對肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力產生抑制作用。

綜上所述，MiR-24可有效抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲，且其作用機制與對MMP-2和MMP-9蛋白表達的下調有關。