基于網絡藥理學探尋β-谷甾醇的作用機制

王旭紅 劉改霞 李耀輝 李哲 張濤

摘要 目的：通過網絡藥理學分析探尋β-谷甾醇的潛在作用機制。方法：首先，利用PubChem數據庫下載β-谷甾醇的2D結構，利用PharmMapper數據庫預測靶標信息，再將結果中輸入UniProt數據庫提取靶標的基因名，然后利用TTD數據庫查詢到靶標對應的疾病信息，STRING數據庫構建基因功能關聯網絡，利用DAVID數據庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：PharmMapper共得到靶標223個，從TTD數據庫得到疾病信息86個，基因功能關聯網絡度值較高的基因有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR和KDR，GO富集分析中具有顯著意義的4個條目有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、類固醇激素受體、類固醇激素介導的信號通路和肽基酪氨酸自磷酸化，通路富集分析中有顯著意義的通路11條，分別為Rho-GTPase循環、NRAGE通過JNK發出死亡信號、神經營養素信號通路、基礎轉錄因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏癥（TLR2/4）、DAP12信號、β-丙氨酸代謝、卵母細胞減數分裂、Rap1信號通路和MyD88：MAL（TIRAP）在質膜上啟動的級聯反應。結論：β-谷甾醇可以通過多靶點，多通路作用于神經系統、生殖系統、免疫系統、感染性疾病及腫瘤在內的多種疾病。

關鍵詞 β-谷甾醇;植物甾醇;膽固醇;網絡藥理學;炎癥;腫瘤;中醫;作用機制

Mechanism of β-Sitosterol Based on Network Pharmacology

WANG Xuhong1，LIU Gaixia2，LI Yaohui3，LI Zhe4，ZHANG Tao2

（1 Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 2 Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 3 Shaanxi Provincial Hospital of Chinese Medicine，Xi′an 710000，China; 4 Traditional Chinese Medicine Development Research Center，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To explore the underlying mechanism of β-sitosterol through network pharmacology.Methods：Firstly，the 2D structure of β-sitosterol was downloaded from PubChem，and targets were predicted by PharmMapper.The results were input into UniProt to extract the gene names of targets.The disease information corresponding to the targets was retrieved from TTD.STRING was used for the construction of an association network of gene functions and DAVID for GO and pathway enrichment.Results：A total of 223 targets and 86 pieces of disease information were obtained from PharmMapper and TTD，respectively.Genes with high degrees in the association network of gene function included RAC1，B2M，ESR1，GTF2F2，AR，and KDR.Four significant items in the GO enrichment analysis were transcription initiation of RNA polymerase Ⅱ promoter，steroid receptor，steroid-mediated signaling pathway，and peptide tyrosine autophosphorylation.There were 11 significant pathways in the pathway enrichment analysis，including Rho-GTPase cycle，NRAGE signals death through JNK，neurotrophin signaling pathway，basic transcription factor，MyD88 deficiency（TLR2/4），IRAK4 deficiency（TLR2/4），DAP12 signaling pathway，β-alanine metabolism，oocyte meiosis，Rap1 signaling pathway，and MyD88：MAL（TIRAP） cascade initiated on the plasma membrane.Conclusion：The findings of this study reveal that β-sitosterol can act on various diseases including nervous system，reproductive system，immune system，infectious disease，and tumors through multi-target and multi-pathway.

Keywords β-sitosterol; Phytosterol; Cholesterol; Network pharmacology; Inflammation; Tumor; Traditional Chinese medicine; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.005

β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）是植物中的一種主要膳食甾醇，存在于油脂、堅果和蔬菜等多種植物當中[1]。其中植物油含有最高濃度的植物甾醇，堅果和種子含有適量的植物甾醇，而水果和蔬菜通常含有最低的植物甾醇[2]。膽固醇通過氧化過程產生膽固醇氧化產物從而成為動脈粥樣硬化的重要危險因素，β-谷甾醇又分類為非膽固醇固醇或中性固醇，雖然在結構上與膽固醇相似，也可能經歷與膽固醇類似的氧化過程，并產生類似的氧化產物，但是這些氧化物的功能卻是通過破壞膽固醇膠束的形成降低膽固醇水平[3]。同時β-谷甾醇也被用于治療其他疾病，包括前列腺增生、炎癥、腫瘤等，因此人們對植物甾醇和β-谷甾醇的興趣與日俱增[4]。前期進行網絡藥理學研究時，在檢索及篩選中藥有效成分及靶標的過程中發現多藥物中均含有β-谷甾醇，并且其口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）2個值均較高，如冬蟲夏草、郁金、蒼耳子、鴉膽子等?；谥兴帉W而言，上述四味中藥分屬不同章節，主治及功效也大不相同?，F代藥理學研究證實β-谷甾醇具有治療高脂血癥、類風濕性關節炎、免疫抑制、前列腺增生、脫發、燒傷等多種疾病的功效[5]。為進一步了解該成分的作用靶點及可治療的疾病從而提供理論支撐，本研究采用網絡藥理學方法對其靶點和作用機制進行可視化分析。

1 資料與方法

1.1 β-谷甾醇靶標的預測

利用PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），以“Beta-sitosterol”作為檢索詞進行檢索，進一步打開“Beta-sitosterol”條目即可看到該成分的2D結構，將2D結構保存為SDF格式進一步分析。見圖1。利用PharmMapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），點擊“Submit Job”上傳上述2D結構的SDF文件、填寫自己郵箱，其他相關信息默認該數據庫的設置，最后點擊“Submit”提交完成。待該數據庫靶標信息預測完成之后，即可下載CSV格式的分析結果，將結果中UniProt一欄的靶標編號分別輸入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）提取靶標的基因名稱即可完成靶標預測。

1.2 β-谷甾醇潛在治療疾病的預測

首先打開TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），將1.1中轉換后的靶標輸入“Search for Targets”搜索框，選擇“Target Name”與靶標相符的基因點擊“Target Info”查看靶標的詳細信息，其中“Disease”一欄即為靶標可能有關的疾病。然后將可查詢到疾病信息的靶標和其相關的疾病列表，將表格導入Cytoscape軟件進行網絡構建，并根據靶標和疾病進行圖形調整。

1.3 基因功能關聯網絡

STRING數據庫（https：//string-db.org/）是最常用的蛋白數據庫，可通過其構建基因功能關聯網絡。首先選擇Multiple Proteins，將預測的靶標輸入搜索框中，Organism選擇為“Homo Sapiens”開始搜索，搜索完成后點擊“Continue”，在設置中將分數選擇為0.7，并隱藏散在的節點，即可得到蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的網絡圖。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是較為全面的生物功能注釋信息平臺，將預測的β-谷甾醇靶點基因名稱輸入DAVID，數據類型選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，表格類型選擇“Gene List”，物種類型和背景均選擇“Homo Sapiens”，再選擇“Functional Annotation Tool”即可選擇進行GO富集分析和通路富集分析。進行GO富集生物過程以及通路富集信號通路的篩選時限定條件為P<0.05并且FDR<0.05以及所研究疾病的相關性。

2 結果

2.1 β-谷甾醇的靶標

通過PubChem搜索得到β-谷甾醇的2D結構。見圖1。PharmMapper的預測（Job ID：200305035857）和UniProt轉換，共得到靶標223個，將化合物和靶標導入Cytoscape軟件進行“化合物-靶標”網絡構建，其中綠色代表化合物，黃色代表所預測的靶標。見圖2。

2.2 β-谷甾醇的疾病預測結果

通過TTD數據庫對223個靶標進行疾病預測，其中有疾病信息的基因52個，對疾病信息進行去重處理后得到疾病信息86個，將靶標和疾病信息導入Cytoscape數據庫構建“靶標-疾病”網絡，其中紅色代表疾病信息，黃色代表靶標。見圖3。拓撲分析發現Solid Tumour/Cancer、AR、KDR的節點度值較高。

2.3 β-谷甾醇的基因功能關聯網絡

為了更直觀地了解β-谷甾醇的作用機制，將所得靶標輸入STRING V11.0平臺構建基因關聯網絡。見圖4。網絡中共包含221個節點，205條邊，平均節點度值1.86。進行拓撲分析發現RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR等基因的節點度值高于其他靶點（>8），上述靶點可能在疾病的治療中發揮關鍵作用，屬于核心靶點。

2.4 GO富集分析和通路富集分析

共得到12個富集的生物過程聚類，分為58個條目，其中具有顯著意義的4個條目為：RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、類固醇激素受體、類固醇激素介導的信號通路、肽基酪氨酸自磷酸化。通路富集分析共獲得9個富集的通路聚類，分為44條通路，P<0.05的通路11條，分別為Rho-GTPase循環、NRAGE通過JNK發出死亡信號、神經營養素信號通路、基礎轉錄因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏癥（TLR2/4）、DAP12信號、β-丙氨酸代謝、卵母細胞減數分裂、Rap1信號通路、MyD88：MAL（TIRAP）在質膜上啟動的級聯反應。見圖5、表3。紅色代表通路結果，綠色代表GO富集結果，黃色代表藥物靶點。見圖5。

3 討論

β-谷甾醇是一種植物甾醇，它與膽固醇結構相似，但并在人類體內合成，而是通過腸道吸收來獲取。相關研究顯示β-谷甾醇的吸收量遠小于膽固醇，口服生物利用度為0.41%，清除率為85 mL/h，周轉率為5.8 mg/d[6]。β-谷甾醇的酯化速度比膽固醇慢，但轉化為原膽汁酸、膽酸和鵝去氧膽酸的速度與膽固醇基本一致[7]。有研究表明β-谷甾醇抑制了培養的癌細胞系鞘磷脂周期的激活，阻滯細胞周期以及刺激凋亡細胞死亡[8]。除抗腫瘤外，也有研究證明其具有抗高膽固醇、炎癥、抗菌和抗真菌的特性[9]。雖然目前關于β-谷甾醇的研究有限，但其作為一種天然產物被認為是安全的，并且抑制多種途徑參與腫瘤的發生和發展。

本研究發現，β-谷甾醇基因功能關聯網絡度值較高的靶點有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR，其中RAC1基因編碼的蛋白是GTPase，屬于小GTP結合蛋白的ras超家族，這一超家族的成員似乎調節著一系列不同的細胞事件，包括細胞生長的控制、細胞骨架的重組和蛋白激酶的激活，與RAC1相關的疾病包括精神發育遲滯、智力殘疾綜合征[10]。B2M基因編碼一種血清蛋白，該蛋白與幾乎所有有核細胞表面的主要組織相容性復合體I型重鏈相關，該蛋白具有主要的β折疊片狀結構，在某些病理條件下可形成淀粉樣纖維，與該基因相關的疾病包括免疫缺陷和淀粉樣變性[11]。ESR1基因編碼雌激素受體，雌激素及其受體對性發育和生殖功能至關重要，但也在乳腺癌、子宮內膜癌和骨質疏松癥組織中發揮作用[12]。GTF2F2是一種蛋白質編碼基因，其主要作用包括形成含有HIV-1 Tat和RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始和啟動子清除的HIV-1延伸復合物[13]。AR在骨髓、乳腺、前列腺組織中表達，編碼的蛋白質有3個主要功能域：N末端域、DNA結合域和雄激素結合域，靶點作為類固醇激素激活的轉錄因子發揮作用[14]。血管內皮生長因子（VEGF）是內皮細胞的主要生長因子，KDR基因編碼VEGF的2個受體之一是一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶，該成分是血管內皮生長因子（VEGF）誘導內皮細胞增殖、成活、遷移、小管形態發生和萌發的主要介質[15]。本研究的靶點富集在11條通路上，其中Rho GTPase是一類重要的信號轉導分子，主要作用是轉換GTP的活化狀態和非活化狀態，在其中發揮開關作用[16]。NRAGE是一種p75神經營養蛋白受體相互作用蛋白，通過JUN依賴性線粒體途徑誘導Caspase激活和細胞死亡，p75NTR與NRAGE相互作用從而導致JUN激酶（JUK）的磷酸化和活化，進一步誘導促凋亡基因的轉錄，并直接激活細胞死亡機制[17]。神經營養素是一類參與神經細胞分化和成活的營養因子，一方面，它通過與Trk酪氨酸激酶受體或p75神經營養素受體（p75NTR）結合發揮其功能，另一方面，p75NTR同時傳輸正信號和負信號，這些信號對神經發育和其他高階活動如學習和記憶起著重要作用?；A轉錄因子是指真核基因轉錄除RNA聚合酶外還需要許多蛋白因子——轉錄因子參加，其中一些轉錄因子是RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始必需的，并且可以維持基礎水平的轉錄。在配體結合時，TLRs通過其各自的TIR結構域異源或均聚并招募MyD88，MyD88通過其死亡結構域（DD）和TIR結構域寡聚并與白細胞介素-1受體相關激酶（IRAKs）相互作用形成Myddosome復合物從而導致轉錄因子活化的信號[18]。IRAK4依賴的TLR7和TLR8信號事件與肝病病毒感染相關，MyD88和IRAK4缺陷患者至今尚未報道易受病毒感染[19]。白細胞介素-1受體相關激酶4（IRAK4）通過IRAK4的死亡結構域和適配型髓樣分化因子88蛋白（MyD88）的同源性相互作用被招募到TLR受體復合物中，基于細胞的分析以及與IRAK4變體的體外蛋白質相互作用分析表明，缺陷IRAK4的功能喪失是由蛋白質生產的喪失或與MyD88的相互作用受損引起的，研究已確定患有常染色體隱性遺傳（AR）型IRAK4缺乏癥的患者，在嬰兒期或幼兒期有臨床癥狀，表現為復發性化膿性細菌感染[20]。在受體連接反應中，DAP12的免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAM）中的酪氨酸殘基被Src家族激酶磷酸化，這些磷酸酪氨酸在髓細胞中形成蛋白酪氨酸激酶SYK和NK細胞中的SYK和ZAP70的對接位點，所有這些中間信號分子導致激酶AKT、CBL和ERK的募集和激活，以及肌動蛋白細胞骨架的重排最終導致細胞活化[21]。β-丙氨酸的代謝主要在大腦和肌肉中，可以提高抗氧化能力和抗疲勞作用。Rap1是一種控制細胞黏附、細胞-細胞連接形成和細胞極性等多種過程的小GTPase，Rap1以高度依賴于細胞類型的方式調節MAP激酶（MAPK）活性，在非活性GDP結合構象和活性GTP結合構象之間循環，Rap1通過調節整合素和其他黏附分子在不同細胞類型中的功能，在控制細胞-細胞和細胞-基質相互作用中起主導作用[22]。MyD88包含一個N末端死亡結構域（DD）和一個C末端TIR，TIR同型相互作用的配體與激活的TLR接觸，而DD模塊招募絲氨酸/蘇氨酸激酶，這些蛋白激酶的募集伴隨著磷酸化，從而導致IRAKs與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）的相互作用[23]。

綜上所述，β-谷甾醇可以通過多靶點、多通路作用于神經系統、生殖系統、免疫系統、感染性疾病及腫瘤在內的多種疾病。

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（2020-04-30收稿 本文編輯：魏慶雙）