茶樹菇多糖提取工藝優化及抗氧化活性研究

◎ 高雅倩，馬詩經，林 麗，楊宜婷

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.廣州市康倫生物技術有限公司，廣東 廣州 510000）

食用菌多糖是一種特殊的生物活性物質，具有增強體液免疫和細胞免疫的功能，國際上將食用菌多糖稱為“生物反應調節物”[1]。茶樹菇（Agrocybe aegerita）隸屬于擔子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬[2]，是溫帶至亞熱帶地區從春季至秋季生長的一種食用菌[3]，中醫認為其具有健脾、利尿、止瀉滲濕等多種效果。研究表明，茶樹菇含有氨基酸、蛋白質、多糖、礦物質等營養成分[4-5]。茶樹菇多糖基本結構以β-（1→6）-支鏈（1→3）-β-D-葡聚糖為主鏈[6-7]，其單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和木糖等[8]。研究證實，茶樹菇多糖具有抗衰老[9]、抗腫瘤[10]、增強免疫力[11]、抗氧化[12]等生物活性。

茶樹菇多糖提取工藝研究包括以茶樹菇子實體或粗碎粉為原料，經超聲波與微波提取、堿法提、酶法提及熱水浸提等工藝制備[13-14]，而茶樹菇多糖主要存在于茶樹菇子實體細胞的細胞壁內，其細胞壁具有蛋白質、多糖結合的結構，因此，上述方法難以破壞細胞壁結構，充分釋放出多糖。本研究對茶樹菇采用超微粉碎處理后再進行熱水浸提，通過單因素與正交試驗方法優化分析了茶樹菇多糖提取工藝中提取溫度、料液比、提取時間、提取次數因素的影響，將最佳工藝所得茶樹菇粗多糖通過不同濃度乙醇醇沉法進一步純化，得到純化后茶樹菇多糖，測定并分析其抗氧化活性，為茶樹菇在抗氧化食品方面的研究開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹菇干制品，由廣州市康倫生物技術有限公司提供；葡萄糖標準品（純度＞99%），購自阿拉丁（Aladdin）試劑公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純，購自廣州化學試劑廠；蒸餾水為實驗室自制。

1.2 儀器與設備

酶標儀1510：美國Thermo Fisher公司；紫外可見光分光光度計UV-3600 Plus：SHIMADZU公司；超微粉碎機WZJ-6B：濟南倍力粉體工程技術有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S22：上海精宏實驗設備有限公司；離心機Z326K：德國Hermle公司；數控超聲波清洗器KQ3200DE：昆山市超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機DYF-400C：上海利聞科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶樹菇多糖的提取

茶樹菇干制品置于60 ℃烘箱干燥20 min后，經高速萬能粉碎機粉碎并過100目篩，然后用超微粉碎機進行超微粉碎10 min，得到茶樹菇超微粉，備用。

稱取茶樹菇超微粉按設定液料比加入水，浸泡20 min后，再按實驗設計的液料比、提取溫度、提取時間、提取次數進行提??；茶樹菇提取液經300目過濾后，置于65 ℃減壓濃縮至1/10體積，經5 000 r·min-1離心10 min，取上層清液加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀后減壓抽濾，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌后冷凍干燥，得茶樹菇多糖凍干粉，測定多糖得率。

1.3.2 茶樹菇多糖含量測定

（1）葡萄糖標準曲線。采用苯酚硫酸法測定[15]。稱取適量葡萄糖標準品，置于105 ℃烘箱中烘至恒重；稱取100 mg葡萄糖標準品，在100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精密吸取葡萄糖標準儲備液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置10 mL容量瓶，加蒸餾水定容，配制成含 葡 萄 糖 0 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和 0.10 mg·mL-1的系列葡萄糖標準溶液。分別移取上述系列葡萄糖標準溶液各1 mL，置10 mL具塞玻璃試管中，依次加入0.5 mL 5%苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸搖勻，靜置5 min，于90 ℃水浴加熱20 min，然后冰浴冷卻至室溫，另取1 mL蒸餾水，按照上述操作，作為空白對照。將上述溶液分別在490 nm波長處測定吸光度值，以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

（2）茶樹菇多糖含量與得率測定。茶樹菇多糖得率測定。將茶樹菇多糖溶于水中，并稀釋至一定質量濃度，吸取1 mL于具塞試管中，測定吸光度，由標準曲線計算出粗多糖的質量分數，計算公式如下：

式中：X-茶樹菇多糖提取率，%；C-測得茶樹菇多糖的濃度，mg·mL-1；V-提取液的體積，mL；n-稀釋倍數；0.9-葡萄糖換算成多糖的正交系數；M-原料質量，g。

1.3.3 茶樹菇多糖提取單因素試驗

以茶樹菇多糖得率為指標，研究不同提取液料比、提取溫度、提取時間、提取次數因素對茶樹菇多糖提取效果的影響。①確定時間2 h、提取溫度為100 ℃條件下，提取1次，探討提取液料比（mL∶g）為10∶ 1、20∶ 1、30∶1、40∶1和 50∶1對茶樹菇多糖提取率的影響。②確定提取液料比為30∶1、提取時間為2 h，提取1次條件下，探討不同提取溫度（70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃）對茶樹菇多糖提取率的影響。③確定提取溫度100 ℃，提取液料比為30∶1，提取1次條件下，探討不同提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h和5 h）對茶樹菇多糖提取率的影響。④確定提取溫度100 ℃，提取液料比為30∶1，提取2 h條件下，探討不同提取次數（1次、2次、3次和4次）對茶樹菇多糖提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

為了進一步確定最佳提取條件，在單因素試驗結果基礎上，以茶樹菇多糖得率為指標，選取液料比A、提取溫度B、提取時間C3個因素進行L9（33）正交試驗對提取條件進一步優化，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 茶樹菇多糖醇沉處理試驗

采用不同濃度乙醇醇沉獲得茶樹菇多糖，取最佳工藝所得茶樹菇提取液，在65 ℃濃縮至提取液體積的1/10，濃縮液中加入4倍量體積的乙醇，使得溶液中乙醇終濃度為70%、80%，放置過夜后，于5 000 r·min-1離心10 min，去上清液得沉淀，冷凍干燥得茶樹菇多糖，記為C1、C2，進行體外抗氧化活性測試。

1.3.6 茶樹菇多糖體外抗氧化實驗

參照文獻方法[16]，測定1.3.5項下的茶樹菇多糖C1、C2的DPPH自由基清除能力。取1 mL不同濃度（0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和 0.80 mg·mL-1）的 C1、C2溶液于試管中，分別加入1.0 mL 0.1 mmol·L-1DPPH溶液，充分混勻后避光反應20 min，在517 nm處測定吸光度為Ai；對照組以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度為A0。DPPH自由基清除率=[A0-Ai+Aj]/A0×100%。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖標準液濃度（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線見圖1，得到回歸方程y=8.875 7x-0.000 3，R2=0.999 6，表明葡萄糖標準品在0.00～0.10 mg·mL-1內濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2 茶樹菇多糖提取工藝優化試驗結果

超微粉碎茶樹菇得到茶樹菇超微粉，并采用單因素與正交試驗優化茶樹菇多糖的提取工藝，茶樹菇多糖提取實驗結果如圖2～圖5所示。

2.2.1 液料比對提取率的影響

由圖2可知，在茶樹菇超微粉熱水浸提過程中，隨著液料比的增加，茶樹菇多糖的得率明顯提高，表示較高的液料比增加了茶樹菇多糖在水中的溶出，液料比為40∶1時，茶樹菇多糖得率最高，液料比為50∶1的茶樹菇多糖得率與液料比為30∶1相比，并非顯著性增加，說明在此條件下，茶樹菇提取液料比為（20～40）∶1最為適宜。

2.2.2 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知，而隨著提取溫度增加，多糖得率顯著增加，提取溫度為100 ℃時，茶樹菇多糖得率最高，表示溫度升高提高了茶樹菇超微粉中多糖的溶出速度。

2.2.3 提取時間對提取率的影響

由圖4可知，在提取時間由1 h提高至2 h時，多糖得率顯著增加，在提取3 h時多糖得率達到最大值，隨著提取時間增加，多糖得率呈下降趨勢，表示延長提取時間，促使茶樹菇中非多糖的水溶性成分溶出，所以多糖得率降低。

2.2.4 提取次數對提取率的影響

由圖5可知，進一步地增加提取次數，茶樹菇多糖提取得率并非顯著升高，提取1次與2次多糖得率相差很小，提取2次及以上時，多糖得率沒有明顯增加，說明在設定條件下提取1次時，茶樹菇多糖已基本溶出完全。由上述結果可知，提取液料比、提取溫度及時間對茶樹菇多糖提取影響較大，需要進一步優化提取條件。

為對比茶樹菇超微粉碎后的提取增益效果，取高速粉碎后的茶樹菇碎粉按提取溫度100 ℃、液料比為30∶1、提取3 h條件下，提取1次時（離心、濃縮及醇沉工藝一致），茶樹菇多糖得率為6.36%±0.26%，明顯低于茶樹菇超微粉的多糖得率。由此可見，茶樹菇經超微粉碎后，其細胞壁破碎，有利于多糖溶出而提高多糖得率。

2.2.5 提取工藝優化

通過表2和表3分析結果可知，影響因素主次順序為B（提取溫度）＞A（液料比）＞C（提取時間）。試驗指標值越大越好，由K值大小得出茶樹菇多糖的最佳提取條件為A2B3C2，即提取溫度100 ℃，液料比為30∶1，提取時間3 h，提取1次；由方差分析得出，提取溫度顯著影響茶樹菇多糖提取工藝（P＜0.05），提取液料比和提取時間無顯著影響。按最佳工藝條件提取茶樹菇多糖，平行3次，結果顯示茶樹菇多糖的平均得率為11.96%±1.06%，高于正交試驗中的最大值。

表2 提取工藝條件優化正交試驗結果與分析表

表3 正交試驗方差分析結果表

2.3 茶樹菇多糖抗氧化實驗結果

不同醇沉濃度獲得茶樹菇多糖的抗氧化結果見圖6。結果顯示，茶樹菇多糖C1、C2對DPPH自由基的清除率呈現出濃度依賴性，C1、C2在質量濃度為0.01～0.80 mg·mL-1對DPPH自由基清除率范圍分別為3.12%～36.77%、4.31%～46.88%。從以上結果分析，不同乙醇濃度醇沉所得的茶樹菇多糖其抗氧化功效也有所差別，濃度越高效果較好。

3 結論

本研究用超微粉碎預處理熱水浸提法從茶樹菇中提取茶樹菇多糖，結果表明，各因素影響茶樹菇多糖提取率的主次順序為：提取溫度＞液料比＞提取時間，經正交試驗方法得其最優化工藝條件為提取溫度100 ℃，液料比為30∶1，提取時間3 h，提取1次。在最佳工藝條件下，茶樹菇多糖平均得率為11.96%±1.06%，茶樹菇多糖得率高于常規粉碎處理后熱水浸提工藝，說明該工藝方法可有效提高茶樹菇多糖得率。此外，不同乙醇濃度醇沉所得茶樹菇多糖對DPPH自由基的清除率呈現良好的量效關系，以乙醇濃度高所得茶樹菇多糖抗氧化效果更好。