肺炎鏈球菌新型疫苗研究進展

陳春梅，顏子乙，江詠梅，崔亞利,，陳慧蓮，徐 黃，苗成林，張 奕，謝 紅，王 惠,王 霞△

(1.四川省眉山市婦幼保健院 a.檢驗科，b.院長辦公室，c.醫務科，四川 眉山 620000；2. 四川大學華西第二醫院檢驗科，四川 成都 610041)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是革蘭氏陽性菌，有莢膜，可定植在人的鼻咽部，作為一種條件致病菌，通常情況下并不致病。當定植的環境發生變化，如機體抵抗力下降、呼吸道病毒感染或年老體弱等情況下，S.pn將透過黏膜防御體系發生侵襲性感染[1]。根據感染范圍，肺炎鏈球菌相關性疾病(pneumococcal disease, PD)分為侵襲性肺炎鏈球菌相關性疾病(invasive pneumococcal disease, IPD)和非侵襲性肺炎鏈球菌相關性疾病(noninvasive pneumococcal disease，NIPD)。2018年公布的最新研究數據顯示，全球約有50萬名小于5歲的兒童感染S.pn 死亡，且發展中國家發病率和死亡率高于發達國家。S.pn 也是引起中國嬰幼兒和老年人發病和死亡的重要病因，全球小于5歲兒童PD病例數中，中國位列第二，占全球總病例數的l2%[1]。基于PD 在全球范圍內的高疾病負擔，WHO 將其列為極高度推薦優先使用疫苗預防的疾病，建議并強調應將S.pn 疫苗優先納入各國免疫計劃[1]。本文回顧現有S.pn 疫苗研發和使用情況。

1 莢膜多糖與已上市疫苗

肺炎鏈球菌莢膜多糖是致病的主要毒力因子，不同莢膜血清型的S.pn 存活能力和致病力不同；根據莢膜多糖的組成差異，S.pn 可分為多種血清型，目前已明確的血清型有100種[2]。目前已上市應用的疫苗以莢膜多糖為基礎，包括肺炎鏈球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide-based vaccine，PPVs)和肺炎鏈球菌多糖蛋白結合疫苗(pneumococcal conjugate vaccines，PCVs)。

PPV-23由23種不同的莢膜多糖抗原純化制備，可對疫苗覆蓋范圍內S.pn 血清型提供保護作用，即血清1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型，據統計，現有疫苗所包含的血清型覆蓋了>85%的致病血清型[1]。然而，PPV-23為非T細胞依賴性抗原，在<2歲嬰幼兒體內難以產生有效的保護性抗體。因此，PPV-23僅推薦65歲以上人群或2～65歲罹患慢性心血管疾病和糖尿病的人群使用[3]。

PCVs將莢膜多糖與蛋白質共價結合，莢膜多糖抗原由非T細胞依賴性抗原轉變為T細胞依賴抗原，使嬰幼兒在免疫后能產生良好的抗體應答，且能產生記憶應答。已上市使用的PCVs 包括PCV-7(血清4、6B、9V、14、18C、19F和23F型)、PCV-10(血清1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F型)和PCV-13(S.pn血清1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型)，包含更多血清型的PCV15,PCV20(20vPnC)處于臨床III期研究，然而PCVs 存在血清型覆蓋有限、制備過程復雜、成本價格高、非疫苗血清型替換等缺點[4]。

另外，在長期推進PCVs 疫苗接種的地區，出現了“血清型置換”現象-即疫苗覆蓋之外的血清型逐漸在臨床致病株中占據流行的優勢地位，且新流行的血清型菌株并沒有喪失相關毒力特征[5]。因此，在越來越復雜的疫苗配方中添加血清型并不是控制抗生素耐藥性威脅的長期解決方案，我們迫切的需要研發一種有效的、經濟的、能發揮廣譜保護作用的肺炎鏈球菌疫苗。

2 具有疫苗潛力的候選蛋白

蛋白疫苗作為S.pn 第三代疫苗，具有較好的免疫原性和高度的保守性，可誘導機體產生非血清型依賴的免疫保護作用，刺激T細胞誘發免疫記憶反應，同時激活黏膜免疫和系統免疫反應。此外，蛋白疫苗制備簡便，成本低，易于規模化生產，因此，蛋白疫苗是目前S.pn 疫苗研究領域的研究熱點。理想的S.pn 蛋白疫苗應具備以下特點：①高度的保守性，并具有較好的免疫原性；②在S.pn 表面表達，或是通過分泌方式表達；③影響S.pn 黏附或定植關鍵毒力因子[6,7]。

2.1 肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)PspA是一種膽堿結合蛋白，存在于幾乎所有S.pn 菌株的細胞表面，可抑制補體介導的肺炎鏈球菌清除。根據PspA 暴露在表面的N端結構域和氨基酸序列變異，可分為三個家族和六個類群；其中，98%的S.pn 臨床分離株來自家族1(第1和2類群)和家族2(第3～5類群)[8]。PspA 具有多種生物學功能，包括抵抗乳鐵蛋白殺傷的抗性[9]，以及在空間位點上阻斷宿主對菌體表面磷酸膽堿殘基的識別，抵抗C 反應蛋白和補體介導的免疫反應[10]。完整的PspA 蛋白在動物模型中具有跨菌株的交叉保護效果，可以抵抗多種血清的S.pn 定植和侵襲性感染[11,12]；然而，由于PspA 氨基酸序列中包含與人類心臟肌球蛋白同源的序列，人們擔心使用完整的PspA 蛋白將誘發針對宿主心肌細胞的自身免疫反應；因此，開發基于PspA 疫苗的新策略將集中在PspA 中不包含與肌球蛋白任何同源性的序列區域[13]。

PspA 的N端有一個α螺旋結構，分為A、B、C3個區域，B區域表現出血清學差異，被稱為進化支區域，共分為5型。Akbari 等人構建了一種基于PspA 的重組蛋白疫苗(PspAB1-5)，將所有5種B區域氨基酸序列融合到一起，并證實了該疫苗將能夠針對多種血清型S.pn 提供顯著的保護[14]。該型疫苗的初步成功，表明融合關鍵蛋白抗原表位的重組融合蛋白方案，可以克服多糖靶位疫苗的局限，為S.pn 蛋白疫苗的研發提供了新的可能。

2.2 膽堿結合蛋白A(choline binding protein A，CbpA/PspC)CbpA/PspC是一種細胞壁相關的表面蛋白，存在于幾乎所有S.pn 菌株表面，PspC 在細菌粘附、侵襲和補體逃逸中起著重要作用，是重要的毒力因子[15]。它通過與分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和層粘連素-整合素受體相互作用而發揮粘連素的作用[16]。PspC能夠直接與補體組分C3結合，并將因子H 招募到細菌表面，導致補體激活減少。

在動物感染模型中，PspC 具有強免疫原性，抗PspC 特異性抗體能夠保護小鼠抵抗S.pn 定植和侵襲性感染。盡管PspC 基因存在于幾乎所有的肺炎鏈球菌中，但它具有高度多態性，使PspC 變異體在結合因子H 的能力上存在差異。據報道，表達與抗體特異性匹配的PspC 變異體的肺炎鏈球菌菌株能被有效地殺死，但抗體對不匹配的PspC變異體無效[17]。由于PspC蛋白序列的高度多樣性，PspC全長蛋白可能不能作為理想的交叉保護性免疫疫苗。

2.3 肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，Ply)Ply是一種膽固醇依賴性的胞膜成孔蛋白毒素，幾乎在所有S.pn 菌株中均有表達[18]；其生物學結構定位在細胞壁，亦可通過輔助Sec 系統分泌至菌體外發揮毒性作用[19]。作為S.pn 最有力的毒力決定因子，Ply 幾乎可以殺死任何宿主細胞。同時，Ply 具有高度的保守性和抗原性，PD 患者會針對Ply 產生高滴度抗體[20]。研究人員通過基因編輯和基因重組技術，對Ply 第146位的丙氨酸進行敲除后，極大減弱了Ply 的蛋白毒性；并將減毒Ply 作為融合蛋白抗原組分，證實了DanJ-ΔA146Ply 可以減輕S.pn 在小鼠肺部的定植數量，并可延長小鼠的生存時間，具有一定的蛋白疫苗潛力[21,22]。

2.4 組氨酸三聯體(fragile histidine triad ,Pht)Pht蛋白家族包括四個高度保守的菌體表面暴露蛋白(PhtA、PhtB、PhtD和PhtE)，其共同特征是具有一個特征性的三組氨酸基序(HXXHXH)，在氨基酸序列中重復5～6次。Pht 氨基酸序列高度保守，對鋅離子具有高親和力，發揮黏附素作用；鼻咽部和肺部的高鋅離子水平可以增加S.pn 的黏附面積和數量[23]。其中，PhtD 變異性最低，并且在幾乎所有的S.pn 菌株表面表達，在不同菌株中具有大于97%的同源性，被認為是具有疫苗潛力的蛋白抗原。

在小鼠和靈長類動物模型中，PhtD 疫苗可以抵抗S.pn 菌體對鼻咽部和肺部的定植和侵襲；然而，這種保護作用具有血清型依賴性，PhtD 抗血清可以抵抗血清 3、4、6A 、6B 型菌株感染小鼠，但無法抵抗血清1、5型菌株的侵襲[24，25]。在Ⅰ期臨床試驗中，PhtD 重組蛋白疫苗具有足夠的安全性和免疫原性，并且在加強免疫后可以顯著提升特異性抗體效價[26]；同時，人類抗PhtD 特異性抗體可以在小鼠模型中針對血清3型菌株發揮被動保護作用[27]。

2.5 延長因子Tu(elongation factor,EF-Tu)EF-Tu是肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等致病菌中最保守、最普遍的表達因子,具有分子伴侶活性，參與肽的生物合成、蛋白質折疊和細胞對應激的反應。Nagai 等研制了一種僅含有S.pn D39菌株中EF-Tu 全長蛋白的重組蛋白疫苗(rEF-Tu)[28]。rEF-Tu 免疫后，小鼠血清中細胞因子的濃度顯著升高，包括IL-6、TNF-α、IFN-y和IL-17。此外，在小鼠模型中還觀察到脾細胞中CD4+T 細胞數量的增加以及IgG 抗體亞類IgG1 和IgG2a 抗體的增加。抗rEF-Tu 血清可增強小鼠腹腔巨噬細胞對S.pn 的吞噬活性，且與S.pn 血清型無關；且rEF-Tu免疫后小鼠可抵抗血清2型和血清15A型(MDR菌株，multidrug resistance)S.pn 菌株的致死劑量攻擊[28]。因此，肺炎鏈球菌EF-Tu 蛋白可能是一種具有疫苗潛力的蛋白抗原，并具有跨S.pn 血清型的保護作用。

3 全菌體疫苗(whole cell vaccines，WCVs)

WCVs包含菌體所有類型抗原，而不需要純化單個組分。因此，它可以在發展中國家中作為PPVs 和PCVs 的經濟替代品。研究表明，S.pn 滅活全菌體和減毒全菌體疫苗能夠通過體液免疫和細胞免疫途徑，提供不依賴于血清型的保護作用[29]。但是目前全菌體疫苗仍存在很多隱患，疫苗的保護效力受到滅活途徑、給藥途徑、免疫途徑等多因素的影響，仍需更多研究去探索。

Malley 等利用S.pn 菌株RX1 構建了一種滅活全菌體疫苗RX1ΔlytA ，它是由血清2型菌株衍生而來的一種不表達莢膜的突變體，并敲除了毒力基因lytA[30]。在動物免疫實驗中，搭配霍亂毒素(cholera toxin,CT)作為佐劑進行鼻內黏膜接種，可以在小鼠和大鼠模型中，提供針對S.pn 血清6B 、3型的保護作用，減少S.pn 鼻咽部定植并延長生存時間[30]；搭配霍亂毒素結合亞基(Cholera toxin binds subunits,CTB)作為佐劑免疫小鼠，可顯著降低S.pn 血清6B 、14、23F 型S.pn 菌株在小鼠鼻咽部和中耳部的定植數量[31]。Lu 等為減少疫苗株自溶以提升菌體產量，對ply 基因進行了修飾，并使用卡那霉素抗性基因替換整個lytA 基因，構建了RM200疫苗株(RX1EPdTΔlytA)。研究表明，RM200 降低了S.pn 血6B 型在小鼠鼻咽部的定植， 并能激活IL-17A 信號通路，具有良好的保護作用[32]。臨床前研究表明，以氫氧化鋁為佐劑的RM200 可誘導小鼠血清中IgG 抗體效價顯著升高和IL-17信號通路效應[33]，可進展到臨床試驗中進行深入評估。Kim 等基于S.pn D39 菌株，敲除其pep27基因和comD基因，制備了一種無法黏附或定植肺組織、血液和腦組織的減毒全菌體疫苗D39Δpep27ΔcomD ，且該型減毒株無法恢復為野生型表型[34]。研究表明，D39Δpep27ΔcomD 免疫后小鼠的血清中，針對D39 株的IgG 抗體效價顯著升高，同時，可誘發抗PspA 特異性IgG 抗體；該減毒疫苗顯著延長了小鼠遭到異源S.pn 菌株攻擊后的生存時間，并且能夠誘導跨血清型的的肺部菌體清除。同時，D39Δpep27ΔcomD 在免疫功能正常和異常小鼠體內的生物安全性也得到驗證，表明其可能作為全菌體疫苗的潛力[34]。

4 肺炎球菌納米疫苗

通常而言，單獨的蛋白作為疫苗候選因子，往往因其免疫原性不高，難以有效刺激宿主發生免疫應答反應，常常輔以佐劑并以肌肉注射的方式接種。但是，肌肉注射難以誘發在上呼吸道黏膜的sIgA 抗體生成，無法在S.pn 定植第一步提供保護作用；因此，需要利用適當的佐劑或免疫遞送系統，通過鼻腔或口腔黏膜途徑，促進抗原的攝取并延長抗原的效應性。

細菌樣顆粒(Bacterioid particles,BLPs)是由食品級乳酸乳球菌通過簡單的熱酸處理制成，形狀和大小與細菌相似(0.5～5 μm)，可作為免疫激動劑應用于黏膜免疫。Wang 等開發了一種基于BLP 遞送系統的新型PspA 蛋白疫苗，PspA 通過與BLP 中蛋白錨點PA 相互作用而進行表面結合[35]。在小鼠模型中，可以抵抗S.pn 感染而發揮保護作用。在此基礎上，Lu 等將PspA 家族1和家族2進行重組融合表達，可在小鼠模型中誘導更高水平的血清特異性IgG 抗體和黏膜特異性sIgA 抗體的表達，并能防止來自家族1和家族2的S.pn 菌株對小鼠的致死性呼吸系統攻擊[36]。

殼聚糖是一種無毒、可生物降解、生物相容的天然多糖，被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準為安全的佐劑和疫苗遞送系統，能夠提高肽類的疫苗的免疫原性并誘導以IgG2a 為主的體液免疫反應。Xu 等使用殼聚糖遞送PsaA 蛋白對小鼠進行鼻內黏膜免疫，可誘導細胞因子IFN-γ 、IL-17A 、IL-4 和特異性IgG 、sIgA 抗體效應水平的顯著提升；同時，可顯著延長小鼠在遭受S.pn 血清3、14型菌株致死性攻擊后的生存時間[37]。Haryono 等使用殼聚糖遞送PCV13 疫苗，相較于Quil-A 佐劑，可誘導IgG1、IgG2a、IgG2b和 IgG3抗體效價的顯著提升[38]。

DOTAP/DC-chol 脂質體屬于陽離子脂質體，在人體中具有生物相容性和可生物降解性，其大小、表面電荷和化學成分是作為疫苗遞送系統時需要考慮的重要因素。Tada 等使用 DOTAP/DC-chol 脂質體搭載PspA 蛋白，向小鼠鼻內黏膜的樹突狀細胞遞送抗原，可對小鼠之后遭受的致死性S.pn 攻擊提供保護作用，延長小鼠生存時間；該研究結果表明，DOTAP/DC-chol 脂質體可能是S.pn 疫苗經鼻腔給藥的潛在佐劑[39]。

5 結論及展望

一個多世紀以來，肺炎鏈球菌相關性疾病在全球范圍內具有較高的發病率和死亡率，特別是在兒童、老年和免疫功能低下的人群中，接種S.pn 疫苗成為了防治PD 的最有效手段。當前，由于免疫原性不強、保護范圍局限、誘發流行株血清型置換、制備工藝成本較高等因素，限制了已上市S.pn 疫苗 PPV-23 和PCV-13 的應用，亟需研發和生產新型S.pn 疫苗。目前科研人員正從蛋白疫苗、全菌體疫苗和新型材料結合疫苗等方面，探索新型S.pn 免疫策略，以尋找兼顧免疫原性強、非血清型依賴、廣譜菌株保護、生產成本低的解決方案。相信在不久的將來，市面上將出現多種新型S.pn 疫苗，以彌補現有疫苗的劣勢，從多途徑抵抗PD 在全球范圍內的流行。