胃癌患者血清中miR-373和miR-592的表達變化及意義

黃奕龍，羅強，黃愛茹

1成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，成都 611730；2四川省人民醫(yī)院康復(fù)科

胃癌在全球是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中排在第五位和第三位，分別約為5.7%和8.2%[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率排名第三，而病死率卻高居第二位[2]。對于中晚期胃癌患者，手術(shù)切除加術(shù)后放化療是目前最常用的治療方案。在過去幾十年，盡管早期診斷、外科手術(shù)治療和化療取得了重大進展，然而胃癌患者仍然具有較高的發(fā)病率和病死率[3]。胃癌術(shù)后并發(fā)癥如切口感染、嘔吐、術(shù)后出血、腸梗阻發(fā)生率高，且患者術(shù)后短期內(nèi)無法正常飲食，導(dǎo)致術(shù)后住院時間以及恢復(fù)時間長，不僅給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)，也給臨床治療帶來挑戰(zhàn)[3-4]。因此，如何早期診斷胃癌一直是臨床研究的熱點。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，為長度在19～25個核苷酸的內(nèi)源性保守小分子，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表達[4]。miRNA的異常表達與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)，對腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和凋亡有重要作用[5]。研究表明，miRNA對腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后評估具有一定價值[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-373和miR-592在胃癌組織中表達上調(diào)，并通過不同的信號通路參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展，可能為胃癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供重要的策略[7-8]。然而，目前miR-373和miR-592在胃癌患者血清中的研究報道較少。本研究主要探討胃癌患者血清中miR-373和miR-592的表達變化，并分析其對胃癌的診斷及預(yù)后評估的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年8月—2016年8月在四川省郫都區(qū)人民醫(yī)院收治的75例胃癌患者(胃癌組)，其中男45例，女30例；年齡37～82(60.59±12.06)歲；既往高血壓12例，糖尿病3例；吸煙7例，飲酒12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；首次診斷為胃癌；經(jīng)病理明確診斷為胃癌；臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；合并心、腦、肝、腎等慢性病；失訪。另外選擇同期在我院進行體檢的40例健康人作為對照組，其中男25例，女15例；年齡32～72(58.78±9.57)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。本研究獲得四川省郫都區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核并通過，所有研究對象簽署臨床研究知情同意書。

1.2 血清中miR-373和miR-592檢測 采用RT-PCR。所有患者術(shù)前及健康對照空腹采血10 mL，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取上層血清用于實驗?？俁NA提取按TRIzol試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)說明書操作步驟操作。采用紫外分光光度法檢查RNA濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行擴增。擴增DNA采用20 μL PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列由廣州銳博生物公司合成。miR-373上游引物序列：5′-TTGTGTCAATATGCGATGATGT-3′，下游引物序列：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；miR-592上游引物序列：5′-CGCGCGAAGTGCTTCGATTT-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-373和miR-592相對表達量。

1.3 隨訪 采用電話回訪和門診復(fù)診相結(jié)合方式隨訪患者預(yù)后生存情況，隨訪截止時間為2020年12月31日。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組和對照組血清中miR-373、miR-592表達比較 胃癌組、對照組血清中miR-373相對表達量分別為5.34±0.99、3.90±0.64，血清中miR-592相對表達量分別為1.85±0.50、1.07±0.17，兩組相比P均<0.01。

2.2 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表達與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、病理分化程度無關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清中miR-373、miR-592表達對胃癌的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清中miR-373表達診斷胃癌的曲線下面積為0.904(95%CI：0.845～0.963，P<0.01)，最佳診斷界值為4.93，此時其特異性為0.950，敏感性為0.787。血清中miR-592表達診斷胃癌的曲線下面積為0.941(95%CI：0.900～0.982，P<0.01)，最佳診斷界值為1.24，此時其特異性為0.850，敏感性為0.893。

2.4 血清中miR-373、miR-592表達與胃癌預(yù)后的關(guān)系 分別以胃癌患者血清中miR-373、miR-592相對表達量中位數(shù)值為截斷值，將患者分別分為miR-373高表達(43例)、miR-373低表達(32例)和miR-592高表達(47例)、miR-592低表達(28例)。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，miR-373低表達者生存率高于miR-373高表達者(P<0.05)；miR-592高表達與miR-592低表達者生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

胃癌作為最常見的惡性腫瘤之一，有早期診斷率低、治療效果差、晚期病死率高的特點。胃癌患者在早期常沒有明顯的癥狀，大部分發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期。接受過根治性手術(shù)的胃癌患者中，有超過一半患者有轉(zhuǎn)移，這類患者的生存期也顯著縮短[9]。因此，早期發(fā)現(xiàn)胃癌，有助于提高其生存率。目前，臨床應(yīng)用的胃腸道腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，主要包括癌胚抗原和糖抗原19-9。但是由于其敏感性較差，不足以用于胃癌的篩查，特別是對早期胃癌的篩查[10]。近年來，miRNA在腫瘤診斷與預(yù)后預(yù)測中的價值逐漸受到重視，在胃癌基礎(chǔ)研究中的報道越來越多，但是臨床的實用價值仍缺乏相關(guān)探索。

miRNA廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程，這提示miRNA可能作為腫瘤的診斷標(biāo)志物或潛在的治療靶點[11]。miRNA常通過與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達，從而降解基因或抑制基因翻譯。miR-21是目前被廣泛研究的一個致癌的miRNA，在膀胱癌[12]、結(jié)腸直腸癌[13]、非小細胞肺癌[14]和胃癌[15]的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用。在胃癌中，miR-21通過靶向調(diào)控PTEN的表達促進腫瘤細胞生長和侵襲[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-373和miR-592在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并通過不同信號通路參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7,17]。

研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，miR-373-3p在胰腺癌患者組織和血清樣本中的表達下調(diào)，且miR-373-3p低表達也與預(yù)后不良的臨床特征有關(guān)[18]。但也有研究表明，miR-373-3p的上調(diào)與腫瘤的早期進展有關(guān)。該研究顯示，miR-373-3p在正常的腺泡細胞中有表達，在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細胞中高表達，而在PDAC腫瘤的最大成分腫瘤間質(zhì)中沒有表達[19]。miR-373表達的差異可能在于患者群體之間的差異。且miR-373-3p在癌癥中的作用方式尚不明確。在一些癌癥中，這種miR-373-3p被描述為腫瘤抑制因子，如在肝門周圍膽管癌中；而在其他癌癥中，miR-373則顯示出促進腫瘤的特性，如在肝細胞癌和乳腺癌中[20]。目前，已有許多基因已被確定為miR-373-3p的靶點，根據(jù)miRNA靶點數(shù)據(jù)庫(MiRDB)，miR-373-3p有899個預(yù)測的基因靶點，其中前兩個是YOD1和LATS2。YOD1和LATS2是調(diào)控細胞周期基因，但LATS2也是p53途徑的調(diào)節(jié)因子[21-22]。從PDAC的角度來看，miR-373最有趣的功能之一是它與致癌的RAS協(xié)同作用，克服了癌細胞增殖所需的p53丟失。正常情況下，p53對RAS誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生有抗增殖反應(yīng)。然而，miR-373的表達使p53失活，從而繞過了衰老機制[23]。這些研究證明miR-373-3p可能通過多種機制發(fā)揮調(diào)控腫瘤的作用，尤其是通過調(diào)控細胞周期與p53發(fā)揮作用，同時與腫瘤的特異性有關(guān)系。本研究結(jié)果表明，胃癌患者血清中miR-373表達升高，提示miR-373可能發(fā)揮促進胃癌進展的作用。進一步將血清中miR-373的表達與患者臨床病理特征進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-373的表達越高，患者的胃癌分期越晚，分化越差。生存分析結(jié)果證實，miR-373高表達提示患者不良的預(yù)后與較短的生存期。這表明，在胃癌中，miR-373可能發(fā)揮促進腫瘤進展的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-373在胃癌組織和胃癌細胞中表達上調(diào)，主要通過下調(diào)TNFAIP1的表達促進胃癌細胞株GES-1的遷移和侵襲[24]。miR-373在胃癌中的具體機制仍需進一步研究。

血清miR-592是一種腫瘤源性miRNA。miR-592的生物學(xué)效應(yīng)已在多種惡性腫瘤中被報道，包括乳腺癌、胃癌和非小細胞肺癌。然而，miR-592是否扮演癌基因或腫瘤抑制因子的角色取決于腫瘤微環(huán)境[25-26]。miR-592在膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)，通過調(diào)節(jié)Rho相關(guān)蛋白激酶抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展。miR-592在大腸癌中作為癌基因發(fā)揮作用，上調(diào)與大腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[27]。一項獨立隊列研究表明，血清miR-592可用于區(qū)分大腸癌患者的分期，具有較高的診斷價值，miR-592表達越高，大腸癌患者的分期越晚。此外，研究表明大腸癌組織中miR-592的失調(diào)與大腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，并且血清miR-592升高被證明是腫瘤源性的，因此血清miR-592可能具有以無創(chuàng)方式預(yù)測大腸癌患者預(yù)后的能力[28]。結(jié)腸癌與胃癌均是胃腸的常見腫瘤，推測miR-592在胃癌中亦可能存在相同的價值。同時，體外研究已經(jīng)證實，miR-592在胃癌中上調(diào)，促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制是通過靶向調(diào)控磷酸肌醇3-激酶/AKT和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化[29]。本研究結(jié)果表明，胃癌患者血清中miR-592表達升高，提示miR-592可能發(fā)揮促進胃癌進展的作用。進一步將血清中miR-592的表達與患者臨床病理特征進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-592的表達越高，患者的胃癌分期越晚，分化越差。但是，隨訪的生存分析結(jié)果表明miR-592的高表達與預(yù)后不存在顯著的關(guān)系，這亦提示miR-592可能在胃癌中不發(fā)揮核心調(diào)控作用。但是僅基于臨床結(jié)果的上述結(jié)果仍需要進一步的多中心及基礎(chǔ)研究進行證實。

本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-373和miR-592診斷胃癌時ROC的曲線下面積分別為0.904和0.941，提示miR-373和miR-592對胃癌具有較高的診斷價值，可作為血清標(biāo)志物篩查胃癌。

綜上所述，本研究結(jié)果提示胃癌患者血清中miR-373和miR-592表達升高，可能與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時對胃癌的診斷也具有一定的價值。此外miR-373高表達與胃癌的生存期相關(guān)，可能作為患者不良預(yù)后生存的標(biāo)志物。