非小細胞肺癌組織中miR-217、E2F3的表達變化及其與預后的關系

趙威，周傳江

本溪市中心醫院胸心外科，遼寧本溪117001

肺癌為全球最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新增180萬肺癌患者，每年有160萬人死于肺癌[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見類型，占肺癌85%以上，盡管近年來靶向治療被廣泛使用，但NSCLC總體存活率仍然較低，且大多數確診時也進入轉移階段，預后更差，5年存活率僅為16%[2-3]。因此迫切需要了解NSCLC發生驅動因素。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，可通過調控癌基因與抑癌基因參與腫瘤發生、侵襲、轉移等生物學行為[4]。研究報道，miR-217在多種腫瘤中發揮抑癌基因或促癌基因作用，參與癌細胞增殖、侵襲、轉移等過程[5-6]。E2F轉錄因子3(E2F3)對細胞周期和DNA復制具有重要調控作用，其異常表達與腫瘤發生發展密切相關[7]。目前尚不明確miR-217與NSCLC的關系，且TargetScan數據庫預測發現，E2F3可能為miR-217下游靶點。本研究旨在分析NSCLC中miR-217、E2F3表達變化，分析二者與NSCLC臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年1月—2015年12月收治的104例接受姑息或根治性切除的NSCLC患者，其中男63例，女41例；年齡38～83(61.54±8.24)歲；吸煙42例；病理分型：腺癌36例，鱗癌68例；腫瘤直徑：≥4 cm 51例，<4 cm 53例；分化程度：低未分化43例，中高分化61例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴結轉移36例。納入標準：經術后病理確診為NSCLC；初診且未接受放化療、手術等治療；病理資料完整；年齡≥18歲；患者及家屬均知情研究；可接受隨訪。排除標準：合并其他腫瘤；隨訪資料不全；嚴重心、肝、腎等臟器疾病；全身感染性疾??；血液系統疾病。本研究經倫理委員會批準。

1.2 組織中miR-217、E2F3 mRNA表達檢測 手術切除NSCLC患者部分癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm)，剪碎并研磨，TRIzol總RNA抽提試劑盒(北京麥瑞博生物科技有限公司)提取組織中總RNA，取1 μL RNA溶液紫外光分度計檢測OD260/OD280和純度，取5 μL RNA溶液凝膠電泳檢測完整性。TaKaRa逆轉錄試劑盒(上海易匯生物科技有限公司)轉錄合成cDNA。miR-217正向引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTACTGCATCAGGAACTG-3′，反向引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；E2F3 mRNA正向引物序列：5′-GATGGGGTCAGATGGAGAGA-3′，反向引物序列：5′-GAGACACCCTGGCATTGTIT-3′。以U6(正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)為內參，進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系：10 μL SYBR GreenⅠMaster、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2 μL DNA模板、8.5 μL RNase-Free H2O。反應條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算組織中miR-217、E2F3 mRNA相對表達量。

1.3 隨訪 患者出院后通過門診或電話方式隨訪5年，隨訪截至2020年12月，統計患者術后5年總生存率，總生存時間定義為入組至隨訪截止時間或死亡。

2 結果

2.1 NSCLC癌組織和癌旁組織中miR-217、E2F3 mRNA表達比較 癌組織中miR-217表達低于癌旁組織，E2F3 mRNA表達高于癌旁組織(P均<0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織和癌旁組織中miR-217、E2F3 mRNA表達比較

2.2 NSCLC癌組織中miR-217與E2F3 mRNA表達的相關性 Pearson相關性分析顯示，NSCLC組織中miR-217與E2F3 mRNA表達呈負相關(r=-0.600，P<0.01)。

2.3 miR-217、E2F3 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 miR-217、E2F3 mRNA表達與NSCLC患者性別、年齡、是否吸煙、病理分型、腫瘤直徑、分化程度無關，與TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-217、E2F3 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系

2.4 miR-217、E2F3 mRNA表達與NSCLC患者預后的關系 隨訪3～60個月，中位49個月，術后5年總生存率為32.69%(34/104)，miR-217高表達(≥0.464，n=57)患者與miR-217低表達(<0.464，n=47)患者術后5年總生存率分別為43.86%(25/57)、19.15%(9/47)；E2F3 mRNA高表達(≥2.613，n=52)患者與E2F3 mRNA低表達(<2.613，n=52)患者術后5年總生存率分別為19.23%(10/52)、46.15%(24/52)。Kaplan-Meier曲線顯示，miR-217高表達、E2F3 mRNA低表達患者術后5年總生存率明顯高于miR-217低表達、E2F3 mRNA高表達患者(χ2=8.190、7.701，P=0.004、0.006)。見圖1。

圖1 不同miR-217、E2F3 mRNA表達NSCLC患者的術后3年生存曲線

2.5 NSCLC患者預后不良影響因素的Cox回歸分析 以性別(男=1，女=0)、年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、吸煙(是=1，否=0)、病理分型(腺癌=1，鱗癌=0)、腫瘤直徑(≥4 cm=1，<4 cm=0)、分化程度(低未分化=1，中高分化=0)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、miR-217(≥0.464=1，<0.464=0)、E2F3 mRNA(≥2.613=1，<2.613=0)為自變量，隨訪時間為時間變量，預后(死亡=1，存活=0)為因變量。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、E2F3 mRNA≥2.613為NSCLC患者預后不良獨立危險因素，miR-217≥0.464為獨立保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 NSCLC患者預后不良影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

NSCLC是全球范圍內一種侵襲性、生長迅速的惡性腫瘤，手術聯合化療和(或)放療是目前主要治療方案，但大多患者確診時已達Ⅲ～Ⅳ期，甚至出現淋巴結轉移，術后復發或轉移幾率高，總體生存率低，本文亦證實TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移為NSCLC預后不良獨立風險因素。隨著腫瘤分子生物學的進展，近年來出現的以腫瘤特異性分子靶標為基礎的靶向療法(如：表皮生長因子受體、間變性淋巴瘤激酶、受體酪氨酸激酶)和免疫療法(如：程序性死亡受體1/程序性死亡分子配體1、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)，雖然顯著延長了NSCLC患生存期，但隨著時間的延長，獲得性耐藥越來越多，因此識別更多治療靶點具有重大意義[3,9]。

表觀遺傳改變是惡性腫瘤最大特征之一，其異常改變與腫瘤發生、增殖、遷移、侵襲、耐藥等密切相關[10]。miRNA為表觀遺傳學研究的重要范疇，其是一類長度約22個核苷酸的內源性非編碼RNA，可在轉錄后結合靶基因mRNA的3′非翻譯區，導致mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而控制靶基因表達。研究表明，人體60%以上的基因表達受miRNA控制，參與調控細胞生長、增殖、分化、能量代謝、周期進展、遷移、凋亡等各種生理過程，在腫瘤發生過程中發揮抑癌或促癌作用[11]。如miR-3180-3p能負向調節叉頭盒P4表達抑制NSCLC增殖和轉移[12]。miR-218能通過調控核因子-κB信號通路抑制NSCLC中葡萄糖代謝，抑制癌細胞增殖和存活[13]。miR-217定位于2號染色體，近年研究表明，其參與多種惡性腫瘤進展[14-15]。劉丹彤等[14]研究顯示，miR-217靶向調控Toll樣受體4抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。JIANG等[15]研究顯示，miR-217靶向調控dickkopf-1促進肝細胞癌進展。上述研究表明，miR-217在不同腫瘤中發揮不同作用。本研究結果顯示，癌組織中miR-217表達低于癌旁組織，并與TNM分期、淋巴結轉移有關，說明miR-217可能在NSCLC中發揮抑癌基因作用。進一步分析顯示，miR-217≥0.464患者術后5年總生存率明顯提升，為預后不良獨立保護因素，說明miR-217低表達參與了NSCLC患者預后不良。但尚不明確其作用機制。沉默信息調節因子2相關酶1可通過調控上皮間質轉化、腫瘤相關基因促進NSCLC細胞增殖、侵襲和轉移[16]。LI等[17]研究發現，上調NSCLC細胞(A549、H1299)中miR-217表達能抑制NSCLC細胞增殖和入侵，雙熒光素酶報告證實miR-217可負向調控沉默信息調節因子2相關酶1發揮抑制增殖、侵襲和促凋亡作用。

腫瘤是一類因正常細胞周期改變而導致的疾病，E2F轉錄因子家族被證實為細胞周期重要調控環節之一[7]。E2F3位于染色體6p22，不同于其他E2F轉錄因子家族成員，其具備兩個亞基，可通過細胞周期蛋白D1形成二聚體，增強細胞G1/S相轉變，促進細胞增殖，阻止凋亡進程[18]。研究顯示，肝癌、子宮內膜癌中E2F3表達上調，與癌細胞增殖、遷移、侵襲相關[19-20]。本研究結果顯示，NSCLC組織中E2F3 mRNA表達增加，與TNM分期、淋巴結轉移有關，同時E2F3 mRNA≥2.613患者術后5年總生存率明顯下降，E2F3 mRNA≥2.613為預后不良獨立風險因素，與既往研究[21]報道一致。Pearson相關性分析也發現，NSCLC組織中miR-217與E2F3 mRNA表達呈負相關，說明二者可能共同參與影響NSCLC患者預后。YANG等[22]通過TargetScan數據庫預測發現，E2F3與miR-217的3′非翻譯區存在結合位點，雙熒光素酶報告證實miR-217能負向調控E2F3抑制癌細胞增殖并誘導凋亡。上述研究進一步佐證了本研究結果，但關于二者是否共同參與影響NSCLC患者預后還需進一步研究證實。

綜上所述，NSCLC組織中miR-217表達下調，E2F3 mRNA表達上調，與TNM分期、淋巴結轉移有關，二者可能共同參與影響NSCLC患者預后。但本研究為單中心研究，且關于miR-217對NSCLC的影響機制尚不明確，還需進一步深入研究。