白花蛇舌草乙醇提取物調控DDR1對大鼠肝癌細胞增殖的影響

吳元芳，張陳麗，張芹

安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，合肥230031

原發性肝癌(PLC)是常見的惡性腫瘤，具有隱匿性、進展快、易轉移、預后差等特點，位居我國惡性腫瘤致死的前列[1]。中醫藥治療PLC具有獨特優勢，從中藥中提取有效的抗腫瘤成分是研發抗癌藥物的重要途徑。新近研究證實，白花蛇舌草是國內外抗腫瘤中藥的研究熱點之一[2-3]。既往研究表明，白花蛇舌草乙醇提取物中的槲皮素、熊果酸以及豆甾醇等有效成分能夠通過抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡、參與腫瘤免疫等途徑發揮抗腫瘤活性[4-5]。在荷瘤小鼠肝癌模型中，中藥白花蛇舌草能夠增強小鼠免疫力，從而清除腫瘤細胞，抑制腫瘤血管生成[6]。另外，研究發現白花蛇舌草有效活性成分能夠抑制人肝癌細胞HepG2增殖，其機制與調控CDK2-E2F1 mRENA表達，阻止G0/G1期相關[7]，但其對PLC大鼠肝癌細胞增殖的調控機制尚不清楚。研究顯示，PI3K/Akt信號通路的激活可促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[8]。盤狀結構域受體1(DDR1)是一種非整合素膠原受體，為酪氨酸激酶蛋白家族成員之一，廣泛參與細胞增殖、凋亡[9]。文獻報道，DDR1能夠促進肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞上皮間質轉化，參與PLC進展，其機制與激活PI3K/Akt信號通路有關[10]。2019年12月—2020年11月，本研究擬通過小劑量二乙基亞硝銨(DEN)誘導構建肝癌大鼠模型，探究白花蛇舌草乙醇提取物對肝癌大鼠腫瘤細胞增殖的影響及其作用機制，以期為白花蛇舌草乙醇提取物用于臨床治療PLC提供更多的基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取雄性、SPF級、體質量180～200 g、周齡6～8周Wistar大鼠82只。實驗動物由安徽醫科大學實驗動物學部提供[合格證號：SCXK(皖)2017-001]，該實驗通過了動物實驗醫學倫理委員會批準(批準號：201907008)。

1.1.2 藥物與實驗試劑 白花蛇舌草乙醇提取物由安徽醫科大學藥學院提供；DDR1兔單克隆抗體、PI3K小鼠單克隆抗體、Akt小鼠單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology；HE染色液、PCNA小鼠單克隆抗體、β-actiin小鼠單克隆抗體、一抗稀釋液、二抗稀釋液、山羊抗小鼠、山羊抗兔、極超敏ECL發光試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術公司。

1.1.3 實驗儀器 G22-W型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；SuPerMax 3000FA型多功能酶標儀(Thermo賽默飛世爾)；M371450型組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)；TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)；Western blotting檢測裝置、GoodLook-1000型成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 PLC模型構建 選取82只Wistar大鼠，腹腔注射DEN(50 mg/kg)，連續16周，每周3次，構建PLC模型[9]。取上述2只大鼠頸椎脫臼處死，病理學檢測肝癌造模成功與否。若大鼠肝組織細胞出現明顯的形態學改變，細胞核變大，排列紊亂并伴有細胞壞死以及炎癥細胞浸潤等情況則表明建模成功。

1.2.2 動物分組及給藥處理 將PLC造模成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只。各組大鼠于造模成功后1 d給予干預，其中后三組分別給予90、180、360 mg/(kg·d)白花蛇舌草乙醇提取物灌胃處理8周，模型組給予乙醇提取物溶劑1 mL/(100 g·d)灌胃處理8周。觀察各組大鼠一般情況。

1.2.3 樣本采集 待各組大鼠灌胃處理8周后，各組隨機選取6只大鼠，腹腔麻醉，腹主動脈取血3 mL，3 000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，放置于-20 ℃冰箱保存留用。待血液采集后，剪取大鼠肝臟組織，一部分放置于-80 ℃冰箱保存，一部分放置于4%的多聚甲醛內保存。

1.2.4 血清ALT和AST水平檢測 全自動血清生化儀檢測各組大鼠血清ALT、AST水平。

1.2.5 肝組織形態學變化觀察 采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠肝組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行肝組織染色，顯微鏡下觀察大鼠肝組織形態學變化。

1.2.6 肝組織PCNA蛋白檢測 采用免疫組化。60 ℃烤箱切片常規脫蠟，常規脫水后按照免疫組化檢測試劑盒行PCNA蛋白染色，DAB顯色，顯微鏡下拍照，并采用Image J軟件定量分析大鼠肝組織PCNA蛋白陽性表達情況。PCNA陽性表達率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.7 肝組織PI3K、Akt、DDR1蛋白檢測 采用Western blotting法。將肝組織碾磨，裂解；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應PI3K小鼠單克隆抗體(1∶1 000)，Akt小鼠單克隆抗體(1∶1 000)，DDR1兔單克隆抗體(1∶500)以及β-actin小鼠單克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對應的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1∶5 000)1～2 h；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。PI3K、Akt、DDR1蛋白表達以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值表示。

2 結果

模型組大鼠精神表現萎靡、毛發散亂，飲食量降低，存活率為80%；低、中、高劑量組大鼠上述狀態得到一定的改善，存活率為100%。

2.1 各組血清ALT和AST水平比較 見表1。

表1 各組血清ALT和AST水平比較

2.2 各組肝組織形態學變化 HE染色結果顯示，模型組大鼠肝組織細胞出現明顯的形態學改變，細胞核變大，排列紊亂并伴有細胞壞死以及炎癥細胞浸潤等情況；低、中、高劑量大鼠肝組織細胞變形程度減輕，僅伴有少量的細胞壞死以及炎癥細胞浸潤(圖1)。

圖1 各組肝組織形態學變化(HE染色)

2.3 各組肝組織PCNA及PI3K、Akt、DDR1蛋白表達比較 見表2。

表2 各組肝組織PCNA及PI3K、Akt、DDR1蛋白表達比較

3 討論

白花蛇舌草是一種來源于茜草科耳草屬植物白花舌草的帶根全草，其功效主要包括清熱解毒、消癰散結、活血化瘀、抗機體炎癥、增強機體的免疫活性等。既往研究證實，白花蛇舌草主要含有環烯醚萜類物質等20多種中藥單體活性成分。其中白花蛇舌草有效活性成分多糖、熊果酸以及齊墩果酸等具有顯著的抗惡性腫瘤活性[11-12]。還有研究發現，白花蛇舌草乙醇提取物作用于宮頸癌細胞能夠顯著抑制宮頸癌細胞增殖[13]。另外，動物實驗也證實白花蛇舌草對耐藥大腸癌細胞的抑制效果明顯升高，能夠上調Caspase-3促進腫瘤細胞凋亡[14]。以上研究均表明白花蛇舌草能夠發揮抗腫瘤活性。手術是PLC目前最有效的治療方案，但多數患者確診時已處于晚期，失去了手術機會。同時肝癌患者放化療的并發癥較多且復發、轉移率高，因此臨床仍缺少理想的治療手段。為此，積極探尋PLC的發病機制并給予藥物干預治療尤為重要。既往研究證實肝癌細胞凋亡和增殖的失衡是造成PLC惡化的重要原因[15]。中醫藥治療PLC具有良好的效果。研究也發現白花蛇舌草乙醇提取物能夠通過抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡進而發揮抗腫瘤活性[16]。另外，網絡藥理學篩選顯示白花蛇舌草有效活性成分可以通過多途徑多靶點的方式發揮抗肝癌的作用[17]。但是既往研究有關白花蛇舌草對肝癌的作用機制尚不完全清楚。結果顯示,與模型組大鼠相比，白花蛇舌草乙醇提取物低、中、高劑量組大鼠血清ALT和AST水平均明顯降低，肝組織形態學損傷得到明顯改善，初步表明白花舌草乙醇提取物能夠改善大鼠肝癌病理狀態，與以往研究結果一致[18]。

PI3K/Akt信號與腫瘤細胞增殖密切相關[19]。其中Akt是PI3K/Akt信號傳導的關鍵分子，活化Akt能夠通過作用于下游多種效應分子而發揮生物學作用。既往研究表明與癌旁組織相比，肝癌組織PI3K、Akt蛋白表達均上調[20]。在體外培養肝癌細胞系HepG2中，PI3K抑制劑LY294002能夠抑制PI3K/Akt信號活化，促進細胞凋亡[21]。本實驗研究發現，與模型組相比，白花蛇舌草乙醇提取物低、中、高劑量組大鼠肝組織PCNA陽性細胞表達率顯著降低，PI3K、Akt蛋白表達亦顯著降低。DDR1是一類與腫瘤密切相關的受體酪氨酸蛋白激酶受體，參與了腫瘤細胞的增殖、遷移以及凋亡等過程[22]。既往研究證實DDR1能夠通過激活PI3K/Akt信號通路，促進抗凋亡蛋白Bcl-xL表達，抑制人乳腺癌和結腸癌細胞凋亡[23]。另外，DDR1能夠通過調控Ras/Raf/ERK信號和PI3K/Akt信號通路增加前列腺癌細胞化療敏感性[24]。因此，筆者推測在PLC大鼠模型中白花蛇舌草乙醇提取物可能通過調控DDR1，抑制PI3K/Akt信號活化，從而改善PLC大鼠病理損傷。因此，本研究通過Western blotting法檢測白花蛇舌草乙醇提取物對大鼠肝癌組織DDR1表達的影響。結果顯示與模型組相比，白花蛇舌草乙醇提取物能夠下調DDR1表達。以上研究結果初步揭示了白花蛇舌草乙醇提取物對大鼠肝癌細胞增殖的調控作用。但是有關白花蛇舌草乙醇提取物是如何通過影響DDR1進而調控PI3K/Akt尚不清楚。

綜上可見，白花蛇舌草乙醇提取物能夠抑制大鼠肝癌細胞增殖，其機制可能與下調DDR1表達，抑制PI3K/Akt信號通路有關。