內脂素在PCOS卵巢組織中的表達變化及其對人卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響

曾彬，耿女，于婉瑩，王琳，韓寶生

唐山市婦幼保健院生殖醫學科，河北唐山06300

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內分泌及代謝紊亂性疾病，是女性不孕的主要原因之一，在育齡期婦女中的發生率為7%～9%[1]。PCOS以慢性排卵障礙、高雄激素血癥和雙側多囊卵巢為特征，常伴有胰島素抵抗、月經紊亂、多毛、痤瘡和肥胖。PCOS的發病機制尚未完全闡明，目前研究認為其發病既與遺傳因素有關，也與環境因素有關。顆粒細胞是卵巢重要組成部分，在卵泡發育成熟及排卵的過程中起著重要的作用。目前研究認為顆粒細胞的異常增殖凋亡是PCOS患者大量卵泡同時發育的主要病理生理基礎[2]。內脂素(visfatin)是近年來發現的一種對機體糖脂代謝有重要作用的脂肪因子，廣泛參與調節機體糖脂代謝平衡，調節機體內分泌和能量代謝[3]。近期研究發現，PCOS患者血清和卵泡液中visfatin的表達明顯增高，可能參與了PCOS的發生[4]。但visfatin在PCOS發病及進展中的具體機制尚不明確，異常的visfatin水平是否影響卵巢顆粒細胞的正常細胞功能尚不清楚。本研究旨在檢測PCOS患者卵巢組織和正常卵巢組織中visfatin mRNA和蛋白的表達變化，并進一步觀察visfatin對卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本 2016年1月—2019年12月在我院因PCOS行手術治療的30例PCOS患者，年齡(30.31±5.19)歲，取手術切除的部分卵巢皮質組織為PCOS組。PCOS患者納入標準：①PCOS診斷符合2003年鹿特丹會議修訂的診斷標準;②不孕并經非手術治療無效;③子宮輸卵管造影術顯示無輸卵管阻塞；④患者丈夫精液檢查未見異常。排除標準：①合并庫欣綜合征、分泌雄性激素的腫瘤及先天性腎上腺皮質增生等內分泌系統疾病;②術前3個月使用過激素類藥物。同期在我院因良性卵巢腫瘤行剝除術的25例患者，年齡(32.45±7.38)歲，取手術切除的部分卵巢皮質組織作為對照組。納入標準：①年齡小于40歲;②患者內分泌檢查正常;③手術時處于卵泡期。排除標準：①患者有不孕史;②術前3個月使用過激素類藥物。兩組年齡比較差異無統計學意義。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑、Lipofectamine2000轉染試劑均購于美國Invitrogen公司；DMEM/F12培養基購于美國Gibco公司；反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購于日本TaKaRa公司；pcDNA3.1-visfatin表達質粒、pcDNA3.1空載質粒及visfatin引物均購于廣州銳博生物技術公司；CCK-8增殖檢測試劑盒、Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒均購于江蘇碧云天生物技術研究所；一抗visfatin、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、GAPDH及辣根標記的二抗均購于美國Santa Cruz公司。

1.3 細胞培養、轉染及細胞分組 人卵巢顆粒細胞KGN購自上海富衡生物科技公司，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中培養。細胞常規培養，隔日更換新鮮細胞培養液，繼續培養細胞待細胞融合度達到80%時使用胰蛋白酶消化收集細胞進行傳代，待細胞傳至第3代時，取對數增殖期的KGN細胞接種于6孔板(2×105個/孔)。應用Lipofectamine2000轉染試劑將pcDNA3.1-visfatin表達質粒或pcDNA3.1空載質粒轉染至KGN細胞。根據轉染物的不同，轉染后的KGN細胞分為pcDNA3.1-visfatin組和pcDNA3.1組。

1.4 visfatin mRNA檢測 采用qRT-PCR。TRIzol法提取卵巢皮質組織或KGN細胞總RNA，分光光度儀檢測提取的RNA的濃度及純度。以RNA為模板，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，取cDNA和PCR引物，應用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR擴增反應。visfatin引物序列:上游為5′-GCCAGCAGGGAATTTTGTTA-3′，下游為5′-TGATGTGCTGCTTCCAGTTC-3′；內參GAPDH引物序列:上游為5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，下游為5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。PCR反應條件：預變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算visfatin mRNA的相對表達量。

1.5 組織中visfatin蛋白與細胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白檢測 采用Western blotting法。取卵巢皮質組織及轉染后24 h KGN細胞，加入RIPA裂解液提取組織及細胞總蛋白，BCA法測定提取的蛋白濃度。每組取等量的蛋白樣品進行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，轉移至PVDF膜后封閉1 h，4 ℃下分別加入一抗visfatin、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體后培養過夜,再加入辣根標記的二抗后室溫下孵育1 h，ECL進行顯影，應用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8實驗。收集轉染后各組KGN細胞，以4×103個/孔分別接種于96孔板，在恒溫培養箱中培養。在轉染后的不同時間點(24、48、72 h)，向每孔加10 μL CCK-8溶液，在恒溫培養箱中繼續避光孵育1 h，采用酶標儀檢測各孔450 nm波長下的光密度(OD)值。

1.7 細胞克隆形成能力檢測 采用平板克隆形成試驗。轉染后24 h，取各組KGN細胞，以200個細胞/皿的密度接種到細胞培養皿中，在恒溫培養箱中繼續培養14 d后取出，PBS洗滌2遍，以4%的多聚甲醛固定細胞15 min，再以0.1%的結晶紫染色20 min，室溫下干燥，在高倍顯微鏡下觀察細胞克隆形成情況，計算細胞克隆數(>50個細胞的集落計為1個有效克隆)。

1.8 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。轉染后24 h，取各組KGN細胞，將細胞密度調整為1×106個/mL，結合緩沖液懸浮細胞，將100 μL細胞懸液、5 μL PI和5 μL Annexin V/FITC加入流式管中混合均勻，室溫下繼續孵育15 min，1 h內上流式細胞儀檢測各組KGN細胞的凋亡情況。

2 結果

2.1 PCOS組、對照組卵巢組織中visfatin mRNA和蛋白表達比較 見表1。

表1 PCOS組、對照組卵巢組織中visfatin mRNA和蛋白表達比較

2.2 兩組KGN細胞中visfatin蛋白表達比較 pcDNA3.1-visfatin組、pcDNA3.1組KGN細胞中visfatin蛋白表達分別為0.82±0.18、0.26±0.09，兩組相比差異有統計學意義(t=4.820，P<0.05)。

2.3 兩組KGN細胞增殖活性和克隆形成能力比較 pcDNA3.1-visfatin組KGN細胞轉染24、48、72 h增殖活性高于pcDNA3.1組KGN細胞(P均<0.05)，見表2。pcDNA3.1-visfatin組、pcDNA3.1組KGN細胞的細胞克隆數分別為(201±39)、(98±26)個，兩組相比差異有統計學意義(t=3.801，P<0.05)。

表2 兩組KGN細胞增殖活性比較

2.4 兩組KGN細胞凋亡率比較 pcDNA3.1-visfatin組、pcDNA3.1組KGN細胞凋亡率分別為(1.9±0.8)%、(9.0±2.1)%，兩組相比差異有統計學意義(t=5.472，P<0.05)。

2.5 兩組KGN細胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表3。

表3 兩組KGN細胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達比較

3 討論

PCOS是常見于青春期及育齡期女性的內分泌代謝紊亂性疾病，嚴重影響著女性的身心健康。近年來隨著生活節奏的加快、工作壓力的增加及人們生活方式的改變，PCOS的臨床發病率也呈現逐年增長的趨勢，PCOS是女性卵巢功能受損、生育能力下降的主要因素之一[5]。近年來雖然已經嘗試應用避孕藥、抗雄激素、二甲雙胍和克羅米芬等治療PCOS，但目前PCOS尚無法治愈[6]。

PCOS與卵巢內在性早期卵泡發育異常有關[7]。越來越多的證據表明，卵巢功能受損伴隨異常的卵泡生成和類固醇生成，以及優勢卵泡發育的缺乏可能是PCOS的主要病理原因。研究發現，在卵泡發育早期，細胞凋亡率較低，增殖率較高，這是導致PCOS患者大量卵泡同時發育而缺乏優勢卵泡的主要原因[8]。卵巢顆粒細胞位于卵泡表面，是卵泡生長及閉鎖過程中最重要的細胞，通過與卵泡膜的相互作用維持卵巢的正常功能，也是卵泡發育過程中起重要作用的細胞。卵巢卵泡母體信號和微環境主要由顆粒細胞和卵丘細胞調節，調節類固醇生成、卵泡生成以及卵母細胞的生長和成熟[9]。因此，顆粒細胞在正常情況及PCOS中的異常卵泡發生中都起著關鍵作用[10]。研究認為，顆粒細胞的異常增殖凋亡是PCOS患者大量卵泡同時發育的主要病理生理基礎，位于卵泡表面的顆粒細胞增殖凋亡的異常會影響卵泡的發育及成熟甚至導致卵泡閉鎖，在PCOS的發病中起著極其重要的作用[11]。

在PCOS的發展過程中，顆粒細胞通常表現為細胞增殖增加和凋亡抑制，并且伴隨著細胞存活因子的大量表達增加，造成大量卵泡同時發育[12]。因此，調控卵泡顆粒細胞的增殖或凋亡可能是未來PCOS治療的方向之一。近年來隨著免疫學及分子生物學的快速發展，研究者發現PCOS患者體內尤其是卵巢組織內一些潛在的調節因子的異常可能與顆粒細胞增殖凋亡的異常發生有關，從而參與了PCOS的發病機制。蔡留蕓等[13]在研究中發現，PCOS患者血清中Chemerin水平增高，上調卵巢顆粒細胞COV434中Chemerin基因表達后，細胞增殖能力上升，凋亡降低。GENG等[14]發現，PCOS患者卵泡液中miR-99a下調，下調卵巢顆粒細胞COV434中miRNA-99a表達能夠促進細胞增殖抑制其凋亡。miR-145被發現對PCOS患者胰島素受體底物1的表達和卵巢顆粒細胞的增殖具有負調節作用，并且通過有效抑制細胞周期蛋白D和E的表達調節卵巢顆粒細胞的增殖[15]。然而，調控PCOS患者顆粒細胞增殖和凋亡的分子機制至今仍不清楚，仍未發現在其中起著最關鍵作用的調控因子。

visfatin是近年來發現的一種主要表達于內臟脂肪組織和(或)巨噬細胞的新型脂肪因子，其基因定位于7號染色體q22.1和q31.33之間，能夠促進細胞對葡萄糖的攝取及轉運過程，在肝臟、骨骼肌中高表達，在機體免疫、炎癥反應、氧化應激等方面發揮著重要的作用，廣泛參與調節機體糖脂代謝平衡，與機體代謝相關性疾病、肥胖及2型糖尿病等多種疾病相關[16]。近期已有較多研究報道，PCOS患者血清中visfatin的水平增高[17-18]，卵泡液中visfatin的水平也明顯增高。雖然有研究認為PCOS患者體內visfatin水平升高可能與機體內胰島素的抵抗有關，可能是對高胰島素血癥的補償性反應[19]。但一項納入1 000多例PCOS患者的meta分析研究結果表明，PCOS患者血清visfatin水平升高，但患者血清中visfatin水平與胰島素抵抗、BMI及總睪酮比值并無相關性[20]。近期研究發現，visfatin與機體的多種炎癥反應有著密切的關系[21-22]。visfatin可以通過影響細胞的能量代謝和炎癥反應從而對細胞的增殖、凋亡以及細胞周期產生明顯的影響[23]。CURAT等[24]在一項研究中報道，visfatin不僅能由機體脂肪細胞合成，而且還可由脂肪組織中的炎癥細胞例如巨噬細胞等合成，表明visfatin可能是一種促炎因子，高表達的visfatin在機體內可能通過促進炎癥反應從而影響機體正常的生理活動。而炎性因子能夠對卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡及分泌功能產生明顯的影響[25]。目前visfatin是否影響卵巢顆粒細胞的增殖凋亡以及在PCOS發病中的具體機制均不明確。本研究結果發現，PCOS組卵巢組織中visfatin mRNA的相對表達量高于對照組。為了進一步驗證結果，本研究通過Western blotting法檢測了卵巢組織中的visfatin蛋白，結果同樣顯示，PCOS組卵巢組織中visfatin蛋白表達高于對照組，證明visfatin在PCOS組卵巢組織中的表達異常增高，與visfatin在PCOS患者血清和卵泡液中的表達情況一致。

為了進一步明確visfatin表達對卵巢顆粒細胞增殖及凋亡的影響，本研究通過體外細胞學實驗，轉染visfatin表達質粒至人卵巢顆粒細胞KGN中，通過基因轉染技術升高卵巢顆粒細胞中visfatin的表達，建立高表達visfatin的卵巢顆粒細胞模型來觀察卵巢顆粒細胞中visfatin異常高表達對KNG細胞增殖活性、克隆形成能力及凋亡的影響。轉染visfatin表達質粒后，pcDNA3.1-visfatin組KGN細胞中visfatin蛋白表達較pcDNA3.1組升高，證明visfatin表達質粒轉染成功，說明本研究成功構建了異常高表達visfatin的卵巢顆粒細胞模型。CCK-8實驗和平板克隆形成實驗是目前檢測細胞增殖最常用的實驗方法。本研究通過CCK-8實驗和平板克隆形成實驗發現，異常高表達visfatin的pcDNA3.1-visfatin組KGN細胞轉染24、48、72 h增殖活性和細胞克隆數均高于pcDNA3.1組，結果提示異常高表達visfatin的卵巢顆粒細胞增殖活性和克隆形成能力明顯升高。進一步通過流式細胞術發現，異常高表達visfatin的pcDNA3.1-visfatin組KGN細胞凋亡率低于pcDNA3.1組,并且其抗細胞凋亡蛋白Bcl-2表達升高，而促細胞凋亡蛋白Bax表達降低，提示異常高表達visfatin的卵巢顆粒細胞凋亡明顯降低。以上說明PCOS患者機體內升高的visfatin表達能夠影響卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡，從而參與PCOS的發病機制。

PI3K/Akt信號傳導通路是體內最重要的細胞信號通路之一,是一個能夠調控細胞增殖、凋亡最重要的信號通路，在腫瘤、炎癥、免疫反應及能量代謝等過程中均發揮重要作用[26]。PI3K被激活后能夠催化細胞表面的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸轉換成為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，從而激活Akt，進而調控Bcl-2家族凋亡相關蛋白的表達，參與細胞凋亡的調控。研究發現PI3K/Akt信號通路可以參與調控原始卵泡的發育、閉鎖、卵母細胞的生長以及卵巢顆粒細胞增殖、凋亡等重要的生理過程，是PCOS發生發展中的重要信號通路[27],也是影響卵巢顆粒細胞增殖凋亡的重要分子通路之一[28]。研究表明，PI3K/Akt信號通路的異常表達會造成卵巢功能的損傷，誘發胰島素抵抗的風險，并且影響卵泡的增殖。目前較多的研究已經證實，visfatin能夠通過活化PI3K/Akt通路參與機體腫瘤細胞增殖、凋亡，肺損傷時細胞凋亡及自噬等重要的生命活動[29]。本研究升高KGN中visfatin表達后，細胞中PI3K/Akt信號通路的關鍵活性蛋白p-PI3K和p-Akt蛋白表達升高，提示異常高表達visfatin的卵巢顆粒細胞中PI3K/Akt信號通路被激活，visfatin可能能夠通過激活PI3K信號通路影響卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡，從而參與PCOS的發病機制。

綜上所述，visfatin在PCOS卵巢組織中表達升高；visfatin能夠促進卵巢顆粒細胞的增殖，抑制細胞凋亡從而參與PCOS的發生發展，其機制可能與其對PI3K信號通路的調控有關。