尋常型銀屑病患者外周血miR-155水平變化及其與Th1/Th2平衡的關系

肖艷玲，李東寧，王勤

朝陽市第二醫院皮膚科，遼寧朝陽 122000

銀屑病是一種免疫相關的慢性復發性炎癥性皮膚疾病。尋常型銀屑病為銀屑病最常見類型，皮損主要表現為斑塊狀和點滴狀，局部或廣泛分布，不僅嚴重影響美觀，還可增加心血管疾病風險，嚴重影響患者生理和心理健康[1-2]。目前研究認為，T淋巴細胞異常活化和浸潤介導的免疫功能失調是銀屑病重要病理生理特征，其中輔助性T細胞(Th)1/Th2軸可能處于銀屑病發生發展的關鍵環節[3-4]。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質的RNA，研究表明其在先天和獲得性免疫系統中發揮重要作用[5-6]。微小RNA(miRNA)-155為miRNA家族重要成員，其在T淋巴細胞的調控中發揮重要作用，已有研究報道其在特應性皮炎、人類免疫缺陷病毒感染、類風濕關節炎等免疫相關疾病中扮演重要角色[7-9]。但miR-155與尋常型銀屑病關系尚不明確，基于此，本研究探討了尋常型銀屑病患者外周血miRNA-155水平變化及其與Th1/Th2平衡的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取朝陽市第二醫院2019年1月—2020年12月收治的95例尋常型銀屑病患者為PV組，其中男53例，女42例；年齡26～62(38.24±5.54)歲；病程4個月～9(4.15±1.08)年。納入標準：符合《中國銀屑病診療指南(2018完整版)》[10]尋常型銀屑病診斷標準；臨床資料完整。排除標準：近兩周接受過抗銀屑病治療；合并其他皮膚疾病；妊娠及哺乳期婦女；合并免疫系統疾病；合并嚴重感染；重要臟器功能損害；體表創傷；嚴重內科疾病。參照《中國銀屑病診療指南(2018完整版)》[10]對PV組患者進行分級，包括受累部位和范圍、皮損嚴重程度、生活質量3個方面，分別使用體表受累面積、銀屑病皮損面積和嚴重程度指數、皮膚病生活質量指數評價。輕度：體表受累面積<3%，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數<3，皮膚病生活質量指數<6；中度：體表受累面積為3%～<10%，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數為3～<10，皮膚病生活質量指數為6～<10；重度：體表受累面積≥10%，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數≥10，皮膚病生活質量指數≥10。根據銀屑病嚴重程度分級分為重度組(n=23)、中度組(n=34)、輕度組(n=38)。另選取同期56例體檢健康者為對照組，其中男31例，女25例；年齡19～65(37.18±5.47)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意本研究。

1.2 外周血miR-155和Th1、Th2相關轉錄因子水平測定 采集PV組入院時和對照組體檢時外周血3 mL，EDTA抗凝，TRIzol總RNA抽提試劑(北京普利萊基因技術有限公司)提取外周血總RNA，TaKaRa反轉錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR反應。miR-155正向引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，反向引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；T-bet正向引物序列：5′-TGTGACCCAGAGATTGTCT-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTTGGAAGCGTTG-3′；GATA結合蛋白3(GATA3)正向引物序列：5′-CGGCAGGACGAGAAAGAGT-3′，反向引物序列：5′-TAGGGCGGGTAGGTGGTGA-3′。反應體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.2 μL正向引物，0.2 μL反向引物，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6.0 μL ddH2O；擴增條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共循環40次。以U6和β-actin作內參校正，U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin正向引物序列：5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物序列：5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′。以2-ΔΔCt法計算外周血miR-155、T-bet、GATA3相對表達量。

1.3 外周血Th1、Th2百分比測定 取1 mL抗凝外周血，RPMI1640培養基等體積稀釋外周血100 μL，加入10 μL刺激劑，5%濃度二氧化碳培養箱37 ℃孵育4 h。加入CD3-PC5抗體、CD8-PC7抗體，避光孵育15 min。裂解，破膜，加入IL-4-PE抗體、干擾素-γ(INF-γ)-FITC抗體，避光孵育20 min。洗滌后使用賽默飛Attune NxT流式細胞儀檢測外周血Th1、Th2百分比，計算Th1/Th2。

1.4 血清Th1、Th2相關細胞因子水平測定 采集PV組入院時和對照組體檢時外周血3 mL，3 000 r/min離心10 min(離心半徑8cm)。取上清，采用ELISA法(檢測試劑盒由上海古朵生物科技有限公司提供)測定IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比較 PV組外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于對照組，Th2百分比低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比較

2.2 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比較 重度組外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于中度組、輕度組，Th2百分比低于中度組、輕度組(P均<0.05)；中度組外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于輕度組，Th2百分比低于輕度組(P均<0.05)。見表2。

表2 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比較

2.3 兩組外周血Th1、Th2相關轉錄因子水平比較 PV組外周血T-bet水平高于對照組，GATA3水平低于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血Th1、Th2相關轉錄因子水平比較

2.4 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者外周血Th1、Th2相關轉錄因子水平比較 重度組外周血T-bet水平高于中度組、輕度組，GATA3水平低于中度組、輕度組(P均<0.05)；中度組外周血T-bet水平高于輕度組，GATA3水平低于輕度組(P均<0.05)。見表4。

2.5 兩組血清Th1、Th2相關細胞因子水平比較PV組血清IFN-γ、IL-2水平高于對照組，IL-4、IL-10水平低于對照組(P均<0.05)。見表5。

表4 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者外周血Th1、Th2相關轉錄因子水平比較

表5 兩組血清Th1、Th2相關細胞因子水平比較

2.6 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者血清Th1、Th2相關細胞因子水平比較 重度組血清IFN-γ、IL-2水平高于中度組、輕度組，IL-4、IL-10水平低于中度組、輕度組(P均<0.05)；重度組血清IFN-γ、IL-2水平高于輕度組，IL-4、IL-10水平低于輕度組(P均<0.05)。見表6。

表6 不同病情嚴重程度尋常型銀屑病患者血清Th1、Th2相關細胞因子水平比較

2.7 尋常型銀屑病患者外周血miR-155水平與Th1/Th2、T-bet、GATA3的相關性 Pearson相關性分析顯示，尋常型銀屑病患者外周血miR-155水平與Th1/Th2、T-bet呈正相關(r分別為0.602、0.749，P均<0.05)，與GATA3/β-actin呈負相關(r=-0.585，P<0.05)。

3 討論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是臨床常見的慢性、復發性皮膚病，目前研究認為其是免疫應答異常、環境誘因、遺傳背景等因素相互作用，導致軟骨細胞、關節滑膜細胞的炎癥反應和(或)角質形成細胞異常增殖，常罹患終身，銀屑病相關病理生理機制是目前研究熱點[11-12]。T淋巴細胞為機體主要免疫細胞，其在聚集于銀屑病皮損前就處于異常活化狀態，浸潤表皮或真皮層后可促進銀屑病進一步發展[3]。成熟的T淋巴細胞能分化為CD4+、CD8+兩大亞群，CD4+可分化為Th1、Th2亞群，當Th1/Th2失衡時則會引起銀屑病臨床表現，因此目前糾正Th1/Th2平衡成為了防治銀屑病重要方向[13]。

miRNA是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3′-非翻譯區部分或完全互補，在轉錄后水平調節基因中發揮作用。研究表明，多種miRNA通過調控Th1/Th2平衡在銀屑病發生發展中發揮重要作用，如miR-120、miR-148a-3p[14-15]。miR-155定位于人染色體21q21.3，實驗敲除小鼠miR-155基因發現，小鼠樹突狀細胞的T淋巴細胞、B淋巴細胞功能明顯受損，提示miR-155在調控免疫系統和維持免疫平衡中發揮不可或缺的作用[16]。后續BANERJEE等[17]研究證實，miR-155表達上調能促進活化的CD4+向Th1分化，而miR-155表達抑制或缺乏會抑制活化的CD4+向Th0分化，提示miR-155能調控Th的分化，影響T淋巴細胞功能和活化后相關細胞因子產生。近年研究也報道，miR-155參與調控強直性關節炎、哮喘的Th1/Th2平衡[18-19]。本研究結果顯示，PV組外周血miR-155水平高于對照組，且輕、中、重度組外周血miR-155水平逐步提升，提示miR-155參與了尋常型銀屑病發生發展。

Th1和Th2分別參與細胞與體液免疫，其中Th1能分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α，Th2能分泌IL-4、IL-10、IL-13，二者分泌的細胞因子存在相互抑制，因此正常狀態下Th1和Th2功能和數量是恒定的，Th1/Th2失衡會導致T淋巴細胞活化，抑制T淋巴細胞免疫應答[20]。本研究結果顯示，PV組外周血Th1百分比、Th1/Th2高于對照組，Th2百分比低于對照組，輕、中、重度組外周血Th1百分比、Th1/Th2逐步提升，Th2百分比逐步降低。說明尋常型銀屑病患者Th1/Th2平衡明顯失調，向Th1方向偏移。同時結果顯示，PV組血清IFN-γ、IL-2水平高于對照組，IL-4、IL-10水平低于對照組，輕、中、重度組血清IFN-γ、IL-2水平逐步提升，IL-4、IL-10水平逐步降低，符合Th1/Th2失衡變化，說明Th1/Th2失衡導致了皮膚炎癥反應發生發展。既往實驗也報道，皮內注射IFN-γ能誘導銀屑病樣皮損出現，阻斷IL-2能抑制T淋巴細胞激活，緩解銀屑病炎癥反應[21-22]。

T-bet與GATA3分別是Th1和Th2的轉錄因子，能選擇性表達于Th1與Th2，決定Th0的分化方向[23]。本研究結果顯示，相比對照組，PV組外周血T-bet水平升高，GATA3水平降低，且輕、中、重度組外周血T-bet、GATA3也存在相應變化，符合Th1與Th2變化。同時尋常型銀屑病患者外周血miR-155水平與Th1/Th2、T-bet呈正相關，與GATA3呈負相關，提示miR-155可能通過調節Th1/Th2平衡參與尋常型銀屑病發生發展。O′CONNELL等[24]研究顯示，miR-155能靶向抑制含SH2區域的肌醇5′磷酸酶1表達，上調T-bet表達，促使T淋巴細胞向Th1方向偏移。彭友華等[25]研究顯示，miR-155能靶向抑制GATA3表達，促使T淋巴細胞向Th1方向偏移。進一步說明miR-155可能通過調節Th1/Th2平衡介導尋常型銀屑病免疫應答，參與尋常型銀屑病發生發展。

綜上所述，尋常型銀屑病患者外周血miR-155水平高，其可能通過調節Th1/Th2平衡介導免疫應答，參與尋常型銀屑病發生發展。