miR-199b-3p對腎癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其機制探討

劉晨溪，趙紅娟，田偉，劉超，徐洋濤，潘巖，尤校雷，周洪月

1保定市第二中心醫(yī)院泌尿外科，河北保定072750；2保定市第二中心醫(yī)院腫瘤科；3邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科；4河北大學附屬醫(yī)院泌尿外科

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～4%，其病死率較高，超過40%[1]。近年來，隨著環(huán)境污染和人口老齡化，腎癌發(fā)病率逐年升高，已成為我國腫瘤相關死亡的主要原因之一。研究表明，腎癌是增殖、侵襲能力較強的惡性腫瘤，大約1/3的患者在確診時已發(fā)生不同程度轉移，不僅給臨床治療帶來了困難，也是導致患者預后差的重要原因[2]。目前對于腎癌增殖、侵襲的機制仍未完全明確，研究腎癌增殖、侵襲及凋亡的機制有助于制定分子治療策略，改善患者預后。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25 nt的內源性非編碼小RNA分子，它可以與靶基因mRNA結合，起到參與核糖核酸代謝、降解靶基因mRNA、調控基因表達的功能，miRNA表達異?？梢詫е聬盒阅[瘤在內的多種疾病發(fā)生，并與惡性腫瘤侵襲、轉移等生物學行為的發(fā)生有密切關系[3]。miR-199b-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA分子。已有研究報道，miR-199b-3p可以抑制頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌的侵襲和轉移，但在腎癌中的研究鮮見報道，對miR-199b-3p的作用機制仍未完全明確[4-6]。2019年7月—2021年6月，本研究探討了miR-199b-3p對腎癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其機制，以期為腎癌診斷、治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；孔質粒、miR-199b-3p mimics、成纖維細胞生長因子2(FGF2)-siRNA質粒均購自于廣州市銳博生物科技有限公司；CCK-8細胞增殖實驗試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室、Matrigel基質膠購自Corning公司；FGF2蛋白一抗、AKT蛋白一抗、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)蛋白一抗、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白一抗、磷酸化ERK(p-ERK)購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞來源及培養(yǎng) 人正常腎小管上皮細胞株HK-2細胞、腎癌細胞株786-O購自中科院上海細胞所。取凍存的人正常腎小管上皮細胞株HK-2細胞、腎癌細胞株786-O，將細胞迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋中進行細胞復蘇，1 min內將細胞全部融化，立即送入無菌室內進行操作。將HK-2、786-O細胞放入離心管中3 000 r/min離心2 min(離心半徑12 cm)，用無菌生理鹽水洗滌2次，再次離心，棄上清后加入無菌生理鹽水吹打混勻，備用。將HK-2細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，786-O細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，分別轉移至培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶輕輕的搖晃使細胞懸液充分混勻覆蓋瓶底。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下進行培養(yǎng)，當細胞生長密度大于80%時進行細胞傳代備用。

1.2.2 細胞轉染及分組 取對數(shù)生長期786-O細胞鋪6孔板，待細胞匯合達到60%～70%時應用Lipofectamine2000進行轉染，在熒光顯微鏡下驗證其轉染效率。按照不同檢測內容建立如下分組：①增殖、凋亡、侵襲能力檢測。分別轉染孔質粒O、miR-199b-3p mimics(10 nmol/L)建立miR-NC組和miR-199b-3p mimics組。②FGF2蛋白水平檢測。分別轉染孔質粒O、miR-199b-3p mimics(10 nmol/L)、miR-199b-3p mimics(50 nmol/L)，建立miR-NC組、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L組、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L組。③PI3K/AKT信號通路關鍵分子的檢測。分別轉染孔質粒O、miR-199b-3p mimics、FGF2-siRNA，建立miR-NC組、miR-199b-3p mimics組和FGF2-siRNA組。所有操作按照說明書進行，轉染后將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.2.3 正常腎小管上皮細胞、腎癌細胞中miR-199b-3p檢測 采用RT-qPCR。取培養(yǎng)72 h的人正常腎小管上皮細胞株HK-2細胞、腎癌細胞株786-O，應用TRIzol法提取細胞總RNA，應用PrimeScript RT Master Mix將總RNA逆轉錄生成cDNA，并應用PCR法進行基因擴增。miR-199b-3p上游引物序列為5′-GRCACAGTAGTCTGCACAT-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6上游引物序列為5′-TCCGACGCCGCCATCTCTA-3′，下游引物序列為5′-TATCGCACATTAAGCCTCTA-3′。反應體系：cDNA底物1.33 μL，TaqMan2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan MicroRNA assay 1.00 μL，ddH2O 7.67 μL。將以上反應體系放入qRT-PCR儀，設定反應條件，反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。將實驗重復檢測3次取平均值，用2-ΔΔCt法計算miR-199b-3p相對表達量。

1.2.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取miR-NC組和miR-199b-3p mimics組細胞，調整細胞密度為2×104個/mL，以100 μL/孔鋪入96孔板中。接種96孔板時每組設置4個重復樣本，將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度。分別于細胞轉染后24、48、72 h將96孔板取出，每個孔加入CCK-8試劑10 μL，輕輕敲擊培養(yǎng)板將CCK-8試劑與培養(yǎng)液混勻，孵箱中孵育2 h，取出后用酶標儀檢測450 nm波長處光密度(OD)值，每組取平均值。

1.2.5 細胞克隆形成能力檢測 應用克隆形成實驗。取miR-NC組和miR-199b-3p mimics組細胞懸液，取適量細胞接種6孔板中，每種細胞設定3個復孔，保證接種數(shù)量為2 500個/孔。37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3天定期更換新的培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)12 d后向每孔加入甲醇1 mL，室溫條件下固定30 min，加入0.1%結晶紫溶液固定30 min。用PBS沖洗細胞3次，在室溫下將6孔板晾干、拍照，在顯微鏡下計數(shù)每個孔細胞的數(shù)量，取平均值作為細胞克隆集落數(shù)。

1.2.6 細胞凋亡情況觀察 應用Annexin V-FITC雙染法細胞流式實驗。取miR-NC組和miR-199b-3p mimics組細胞，調整細胞密度至1×106個/mL，并用100 μL 1×binding buffer重懸細胞，并加入到1.5 mL EP管中。避光條件下加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI Staining Solution 5 μL，輕輕混勻，室溫條件下反應15 min，再次加入400 μL 1×binding buffer。將配置好的細胞于1 h內應用流式細胞儀進行檢測，并應用Flowjo軟件分析實驗結果。

1.2.7 細胞侵襲能力檢測 應用Transwell侵襲實驗。取miR-NC組和miR-199b-3p mimics組細胞，調整細胞密度為2×104個/mL。向每組Transwell小室上室中加入相應的細胞100 μL，下室中加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將Transwell板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。取出Transwell板，應用PBS沖洗2次，加入4%甲醛固定，并用濃度為0.1%的結晶紫染色10 min后用PBS洗滌2次，室溫下靜置0.5 h，顯微鏡下觀察穿過濾過膜的細胞，并計數(shù)。

1.2.8 miR-199b-3p的靶基因預測 應用生物信息學方法。在TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)搜索欄中輸入miR-199b-3p，miRNA靶基因做GO功能分析，預測miR-199b-3p的靶基因，選擇自由能低且功能相關的基因作為本實驗檢測對象，進行基因功能學分析。

1.2.9 細胞中FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白檢測 應用Western blotting法。取miR-NC組、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L組、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L組細胞，提取總蛋白，電泳，選擇PVDF膜轉膜，封閉，滴加FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK、β-actin蛋白一抗(以β-actin為內參)，將PVDF膜TBST沖洗，避光條件下加入生物學二抗孵育1 h，應用Image Lab軟件測量蛋白相對表達量。同樣方法取miR-NC組、miR-199b-3p mimics組和FGF2-siRNA組細胞，檢測FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 正常腎小管上皮細胞、腎癌細胞中miR-199b-3p表達比較 miR-199b-3p在腎癌細胞株786-O、人正常腎小管上皮細胞株HK-2細胞的相對表達量分別為0.48±0.12、1.00±0.03，兩者相比t=9.400,P<0.01。

2.2 miR-199b-3p對腎癌細胞增殖能力的影響 CCK-8增殖實驗結果顯示，miR-199b-3p mimics組24、48、72 h細胞增殖能力低于miR-NC組(P均<0.05)，見表1；克隆形成實驗結果顯示，miR-199b-3p mimics組細胞克隆集落為(34±5)個，低于miR-NC組的(126±8)個(t=16.891,P<0.01)。

表1 各組細胞OD450比較

2.3 miR-199b-3p對腎癌細胞凋亡情況的影響 miR-199b-3p mimics組細胞凋亡率[(31.4±2.9)%]高于miR-NC組[(24.8±2.4)%](t=3.037,P=0.039)。

2.4 miR-199b-3p對腎癌細胞侵襲能力的影響 miR-199b-3p mimics組細胞侵襲能力[(39±8)個/區(qū)域]低于miR-NC組[(62±12)個/區(qū)域](t=3.906,P=0.003)。

2.5 miR-199b-3p對腎癌細胞中FGF2表達的抑制 TargetScan7.2軟件在線預測顯示，F(xiàn)GF2 3′非編碼區(qū)與miR-199b-3p具有結合位點，見圖1。Western boltting法實驗結果顯示，miR-NC組、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L組、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L組FGF2蛋白表達分別為0.87±0.11、0.42±0.06、0.23±0.04，轉染miR-199b-3p后FGF2蛋白表達降低(F=12.365,P<0.01)，三組兩兩比較P均<0.05。

圖1 TargetScan7.2軟件在線預測結果

2.6 miR-199b-3p對腎癌細胞中FGF2及PI3K/AKT信號通路關鍵分子表達的調控 miR-199b-3p mimics組、FGF2-siRNA組細胞中FGF2、p-AKT、p-ERK蛋白表達低于miR-NC組，AKT、ERK蛋白高于miR-NC組(P均<0.05)，見表2。

表2 各組FGF2、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白表達比較

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，腎癌發(fā)病率僅次于膀胱癌，是泌尿系統(tǒng)第二大惡性腫瘤[7]。腎癌組織學類型包括透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、嫌色細胞癌、未分化癌等，其中透明細胞癌占腎癌的70%～80%，是最常見的組織學類型[8]。目前手術仍然是臨床上治療腎癌的主要方法，但由于腎癌早期易發(fā)生侵襲和轉移，使患者喪失了手術根治的機會[9]。據(jù)統(tǒng)計，約有1/3的腎癌患者在初次診斷時已經發(fā)生轉移，加之腎癌對放療、化療不敏感，大部分患者預后較差，中位生存期不足2年，5年生存率低于10%[10]。惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移是一個錯綜復雜的過程，涉及多種基因、蛋白和細胞因子的相互作用[11]。從分子生物學方面對腎癌細胞增殖、侵襲等過程進行深入研究，有利于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，并進行針對性的干預，明確預后。

miRNA是一類廣泛存在于各類動植物細胞中的非編碼小RNA分子，目前在人類中已鑒定的miRNA超過200種，這些miRNA在組織發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、組織代謝、細胞分化等方面發(fā)揮著重要的作用[12-14]。機體中的各種miRNA與基因形成了復雜的調控網絡，參與機體生理和病理過程[15]。miR-199是具有抑癌作用的miRNA分子[16]，其成員包括miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p等。已有報道顯示，miR-199家族在肝細胞癌、宮頸癌、結腸癌等發(fā)揮抑癌作用，可以抑制肝細胞癌、宮頸癌、結腸癌的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。miR-199b-3p是miR-199家族的重要成員之一[20]。研究表明，miR-199b-3p可以通過靶向磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C epsilon抑制前列腺癌的惡性增殖和侵襲[21]。

目前，miR-199b-3p在腎癌中的作用還未知。本研究結果顯示，在786-O細胞中miR-199b-3p呈異常低表達，提示在腎癌發(fā)生、發(fā)展中miR-199b-3p可能扮演“抑癌基因”的角色。為了進一步驗證miR-199b-3p在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究分別向786-O細胞轉染了空質粒O和miR-199b-3p mimics，并應用CCK-8增殖實驗和克隆形成實驗檢驗各組細胞增殖能力，結果顯示miR-199b-3p mimics組細胞增殖能力低于miR-NC組，證實miR-199b-3p可以抑制786-O細胞的增殖。同時，細胞流式實驗結果顯示，miR-199b-3p mimics組細胞凋亡高于miR-NC組。眾所周知，細胞增殖能力升高和凋亡能力降低可導致細胞惡變，并促進腫瘤細胞的不斷演進。提示，對miR-199b-3p進行調控，提高miR-199b-3p的表達可抑制腎癌的發(fā)生，并為腎癌精準治療提供新的策略和研究方向。

侵襲是惡性腫瘤的重要生物學特征，而腎癌也是一種侵襲能力較強的惡性腫瘤。本研究結果表明，轉染miR-199b-3p mimics后786-O細胞侵襲能力降低，分析miR-199b-3p可以通過抑制某些侵襲相關基因，導致786-O細胞侵襲能力降低。既往有研究報道，miR-199b-3p還可以通過抑制ITGA3抑制頭頸部腫瘤的侵襲和轉移[22]。

要了解miRNA功能的最佳途徑之一就是闡明其靶點[23]，本研究應用生物信息學的方法篩選了miR-199b-3p可能作用的靶點，結果顯示FGF2 3′非編碼區(qū)與miR-199b-3p具有結合位點，但有結合位點是否有調控功能需要進一步驗證。為了進一步驗證結合位點是否有功能，本研究向786-O細胞中分別轉染孔質粒、及不同劑量的miR-199b-3p mimics(10、50 nmol/L)，Western blotting法結果顯示，轉染miR-199b-3p后FGF2蛋白表達降低，轉染miR-199b-3p mimics劑量越高，F(xiàn)GF2蛋白表達降低越明顯，表明miR-199b-3p mimics可以調控FGF2蛋白，導致FGF2蛋白表達降低。這一結果證實miR-199b-3p與FGF2具有靶向調控關系，結合生物信息學預測結果，可以推斷miR-199b-3p可以通過與FGF2 3′非編碼區(qū)結合導致FGF2表達降低。FGF2是由多種細胞產生的細胞生長因子，它可以促進內皮細胞遷移和平滑肌細胞增殖，在組織修復、血管形成等方面發(fā)揮重要作用[24]。最近研究表明，F(xiàn)GF2可以促進腫瘤細胞增殖和侵襲[25]。SHI等[26]報道，F(xiàn)GF2可以通過影響PI3K/AKT信號通路促進食管癌增殖和侵襲。XU等[27]報道，F(xiàn)GF2可以經PI3K/AKT信號通路促進鼻咽癌的發(fā)生。AKT、ERK是PI3K/AKT信號通路的關鍵分子，當AKT、ERK發(fā)生磷酸化時可以激活PI3K/AKT信號通路，并促進細胞的增殖及血管生成，抑制細胞凋亡[28]。本研究中，miR-199b-3p mimics組、FGF2-siRNA組細胞中FGF2、p-AKT、p-ERK蛋白表達低于miR-NC組，AKT、ERK蛋白表達高于miR-NC組，表明miR-199b-3p可以使AKT、ERK磷酸化水平降低，進而抑制AKT、ERK激活。但由于條件限制，本研究沒有進行雙熒光素酶實驗對miR-199b-3p的靶點進行驗證，其深入的分子機制后續(xù)需要進一步研究驗證。

綜上所述，miR-199b-3p在腎癌細胞中低表達，可以抑制腎癌細胞增殖、侵襲，促進其凋亡，其作用機制可能與miR-199b-3p負靶向調控FGF2、PI3K/AKT信號通路有關。