帕金森病患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平變化及臨床意義

白雪，董巧云，王博，趙麗，姚彥

滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)五科，河北滄州061000

帕金森病(PD)是中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、精神障礙、自主神經(jīng)功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，以及姿勢(shì)平衡障礙、動(dòng)作遲緩、震顫等運(yùn)動(dòng)障礙，隨著病情進(jìn)展運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀會(huì)持續(xù)加重，造成了巨大的社會(huì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是PD發(fā)生的關(guān)鍵病理生理機(jī)制[2]。微小RNA(miRNA)是一種單鏈非編碼內(nèi)源性RNA分子，能調(diào)控靶基因表達(dá)，參與神經(jīng)元增殖、分化、凋亡等生理病理過(guò)程[3]。研究報(bào)道，miR-103a-3p能靶向腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)控阿爾茨海默病神經(jīng)元增殖、分化、凋亡，參與阿爾茨海默病進(jìn)展[4]。另有研究報(bào)道m(xù)iR-486-5p是神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)劑[5]。目前關(guān)于血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平與PD的關(guān)系研究報(bào)道較少，本研究旨在分析PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平變化，探討二者對(duì)PD的診斷價(jià)值，以期為臨床診治PD提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年7月—2021年1月我院收治的183例PD患者為PD組，其中男112例，女71例；年齡31～88(62.22±8.87)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～28(23.40±2.05)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016版)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；初次確診，未接受任何治療；病歷資料完整；患者及家屬均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：明確腦外傷史；化學(xué)藥物、創(chuàng)傷等誘發(fā)的PD；合并免疫、血液系統(tǒng)疾病；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙；合并嚴(yán)重感染；近期服用激素類(lèi)抗炎藥物。另選取同期75例健康體檢者為對(duì)照組，其中男46例，女29例；年齡43～75(60.52±7.61)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～28(23.47±2.09)kg/m2。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清miR-103a-3p、miR-486-5p檢測(cè) 采集PD組入院后次日和對(duì)照組體檢時(shí)空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，分離血清于-80 ℃冰箱中保存至檢測(cè)。TRIzol試劑盒提取血清總RNA，TaKaRa試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Narodrop驗(yàn)證cDNA濃度及純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-103a-3p正向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，反向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；miR-486-5p正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL cDNR、1 μL上游引物、2 μL上游引物、10 μL SYBR Green Master Mix、6 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(40個(gè)循環(huán))。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-103a-3p、miR-486-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.3 病情分級(jí) PD患者入院后12 h內(nèi)參考Hoehn-Yahr分級(jí)評(píng)估PD嚴(yán)重程度。Hoehn-Yahr分級(jí)由HOEHN等[7]于1967年編制，分為0級(jí)、1級(jí)、1.5級(jí)、2級(jí)、2.5級(jí)、3級(jí)、4級(jí)、5級(jí)。0級(jí)：無(wú)PD癥狀；1～2級(jí)：輕度PD；2.5、3級(jí)：中度PD；4、5級(jí)：重度PD。根據(jù)Hoehn-Yahr分級(jí)將PD患者分為重度組(n=53)、中度組(n=71)、輕度組(n=59)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比較 PD組血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平低于對(duì)照組(P均<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比較

2.2 不同病情PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比較 輕度組、中度組、重度組血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平依次降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同病情PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平比較[M(P25,P75)]

2.3 PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平與Hoehn-Yahr分級(jí)的相關(guān)性 PD組患者Hoehn-Yahr分級(jí)為3.00(2.00,4.00)，Spearman相關(guān)性系數(shù)顯示，PD患者血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平與Hoehn-Yahr分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)(rs分別為-0.865、-0.815，P均<0.001)。

2.4 血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平對(duì)PD的診斷價(jià)值 ROC曲線(xiàn)顯示，miR-103a-3p+miR-486-5p診斷PD的AUC大于miR-103a-3p、miR-486-5p單獨(dú)診斷(Z分別為3.089、3.293，P=0.002、0.001)。見(jiàn)表3。

表3 血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平對(duì)PD的診斷價(jià)值

3 討論

PD是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變和路易小體形成為主要病理變化的多系統(tǒng)受累神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其患病率隨著年齡增長(zhǎng)而升高，我國(guó)>65歲人群PD患病率為1.7%，預(yù)計(jì)到2020年病例將增加至500萬(wàn)[8]。PD早期診斷有助于延緩病情進(jìn)展，改善運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀，目前臨床主要依靠患者臨床表現(xiàn)，尚缺乏特異性指標(biāo)，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，已出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)元損傷，故探索其生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)部分或完全匹配結(jié)合，介導(dǎo)靶基因翻譯抑制或降解，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)，與PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。如miR-1301-3p能靶向間隙連接蛋白β1，通過(guò)抑制α-突觸核蛋白介導(dǎo)的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域、富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3的激活抑制PD進(jìn)展[10]。miR-421能靶向肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D加重神經(jīng)毒性并促進(jìn)細(xì)胞死亡進(jìn)而促進(jìn)PD進(jìn)展[11]。miR-103a-3p位于人染色體5q34，近年多項(xiàng)研究均報(bào)道m(xù)iR-103a-3p參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生，如HE等[12]研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中miR-103a-3p表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-103a-3p表達(dá)能靶向Zic4抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管生成，抑制其惡性行為。LIGUORI等[13]通過(guò)高通量下一代測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p在肌萎縮側(cè)索硬化患者外周血中低表達(dá)。CHANG等[14]通過(guò)全基因組分析發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p在阿爾茨海默病中表達(dá)下調(diào)。但關(guān)于miR-103a-3p與PD的關(guān)系尚不明確。本研究顯示，PD組血清miR-103a-3p水平低于對(duì)照組，提示miR-103a-3p低表達(dá)可能參與PD發(fā)生。進(jìn)一步分析顯示，輕度組、中度組、重度組血清miR-103a-3p水平依次降低，與Hoehn-Yahr分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明血清miR-103a-3p低表達(dá)與PD發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)。其機(jī)制可能與miR-103a-3p能靶向鈣調(diào)蛋白1抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是PD的主要病理生理機(jī)制，鈣調(diào)蛋白1是一種能與鈣離子結(jié)合的多功能蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)元死亡與存活的調(diào)節(jié)。近年多項(xiàng)研究均表明鈣調(diào)蛋白1高表達(dá)是氧化應(yīng)激、致線(xiàn)粒體功能障礙等因素促進(jìn)神經(jīng)退行性變的重要原因[15-16]。徐向玲等[17]研究顯示，上調(diào)miR-103a-3p表達(dá)能靶向鈣調(diào)蛋白1減輕1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的PD細(xì)胞凋亡。研究[18]也表明，運(yùn)動(dòng)上調(diào)血清miR-29a-3p水平具有改善PD患者認(rèn)知功能作用，進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果。

miR-486-5p位于人染色體8p11.21，既往研究多報(bào)道其與腫瘤的關(guān)系，如miR-486-5p在非小細(xì)胞肺癌血清中水平高，能靶向細(xì)胞黏附分子1/緊密連接軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]。miR-486-5p在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，能靶向卵泡抑素樣蛋白3抑制胃癌細(xì)胞活力、增殖和遷移[20]。近年DORI等[5]通過(guò)分析與神經(jīng)發(fā)生和大腦發(fā)育相關(guān)miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p是神經(jīng)發(fā)生和大腦發(fā)育的調(diào)節(jié)劑，提示miR-486-5p可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年研究認(rèn)為，PD可能起源于腸道，其機(jī)制涉及腸道滲透性增加、氧化應(yīng)激水平升高、α-突觸核蛋白由腸道向腦傳播等[21]。近期KURZ等[22]通過(guò)結(jié)腸活檢和Illumina高通量測(cè)序分析PD患者腸道m(xù)iRNA發(fā)現(xiàn)，PD患者腸黏膜中miR-486-5p表達(dá)上調(diào)。但本研究結(jié)果顯示，PD組血清miR-486-5p水平低于對(duì)照組，與KURZ等[22]報(bào)道的miR-486-5p在PD患者中表達(dá)上調(diào)存在差異，這可能與檢測(cè)樣本不一樣有關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，血清miR-486-5p水平高，癌組織中miR-486-5p低表達(dá)，且血清高水平miR-486-5p與患者生存不利相關(guān)，癌組織中miR-486-5p低表達(dá)則能作為腫瘤抑制因子抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[19]。因此有關(guān)miR-486-5p在PD血清與腸道中的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步分析顯示，輕度組、中度組、重度組血清miR-486-5p水平依次降低，與Hoehn-Yahr分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明血清低水平miR-486-5p參與PD發(fā)展和進(jìn)展。其機(jī)制可能與miR-486-5p能靶向瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族M成員2(TRPM2)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。瞬時(shí)受體電位離子通道是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布的通道蛋白，TRPM2為瞬時(shí)受體電位離子通道家族典型成員，異常激活可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+積累，促進(jìn)細(xì)胞死亡，是PD發(fā)生的關(guān)鍵因素[23-24]。彭秀華等[25]研究顯示，上調(diào)miR-486-5p表達(dá)能靶向TRPM2抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的PD細(xì)胞凋亡和自噬。

本研究通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miR-103a-3p、miR-486-5p水平均可作為PD診斷指標(biāo)，且miR-103a-3p+miR-486-5p診斷PD的AUC為0.868，大于二者單獨(dú)診斷，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)能提升PD診斷價(jià)值，有助于發(fā)現(xiàn)更多PD高風(fēng)險(xiǎn)人群。

綜上所述，miR-103a-3p、miR-486-5p在PD患者血清中水平低，與PD病情進(jìn)展密切相關(guān)，可作為PD診斷指標(biāo)。但miR-103a-3p、miR-486-5p對(duì)PD相關(guān)影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。