高血壓性腦出血患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平變化及臨床意義

臧雪風(fēng)，史明語，王禮玲

鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇鹽城224000

高血壓性腦出血(HICH)是自發(fā)性腦出血的常見類型之一，占所有自發(fā)性腦出血的50%～70%，具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高的特點(diǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(miRNA)參與神經(jīng)元功能調(diào)節(jié)，與腦出血后神經(jīng)行為障礙和神經(jīng)炎癥有關(guān)[2]。miR-141-3p是具有神經(jīng)保護(hù)作用的miRNA，可通過抑制促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)釋放減輕缺血性腦卒中介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[3]。在腦出血大鼠模型中，注射miR-141-3p激動(dòng)劑可縮小血腫體積，減輕血腫周圍腦組織損傷[4]。miR-29a-3p是與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的miRNA，在兒童自閉癥患者表達(dá)下調(diào)，且與認(rèn)知功能受損有關(guān)[5]，上調(diào)miR-29a-3p表達(dá)可改善帕金森患者認(rèn)知功能[6]。目前少見miR-141-3p、miR-29a-3p與HICH關(guān)系研究，鑒于此本研究觀察了HICH患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平變化，分析其與病情以及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2020年6月我院收治的167例HICH患者(HICH組)，其中男110例、女57例，年齡55～74(65.23±6.19)歲，根據(jù)斯堪納維亞卒中量表(SSS)評分[7]將患者分為輕型組(0～15分，42例)、中型組(16～30分，67例)和重型組(31～45分，58例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HICH符合《自發(fā)性腦出血診斷治療中國多學(xué)科專家共識》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②發(fā)病至入院時(shí)間小于24 h；③住院時(shí)間超過72 h；④年齡18周歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦外傷史，實(shí)驗(yàn)室檢查提示凝血功能障礙導(dǎo)致的腦出血；②經(jīng)顱腦CT/MRI影像檢查提示腦血管結(jié)構(gòu)異常、顱內(nèi)腫瘤、煙霧病等引發(fā)的腦出血；③入院后已經(jīng)形成腦疝或死亡患者。另選擇同期于門診體檢的64例健康志愿者為對照組，均排除高血壓、心腦血管疾病，其中男44例、女20例，年齡51～78(65.02±6.07)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得我院倫理會批準(zhǔn)，受試者或其家屬簽署同意書。

1.2 血清miR-141-3p、miR-29a-3p檢測 HICH組入院后立即(對照組入組當(dāng)日晨時(shí))采集空腹靜脈血3 mL注入干燥試管，待血液凝固后取上清液，3 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)。TRIzolTMplus RNA Purification Kit(美國Invitrogen公司)提取總RNA，Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)評估RNA質(zhì)量，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國賽默飛Applied Biosystems)上進(jìn)行3次重復(fù)PCR分析。反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次。引物序列：miR-141-3p上游為5′-GGTCCTAACACTGTCTGGTAAAGTGG-3′，下游為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29a-3p上游為5′-TTCCTCGGTAGCACCATCTG-3′，下游為5′-TATCCTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′；β-actin(內(nèi)參)上游為5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游為5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-141-3p、miR-29a-3p相對表達(dá)量。采用BS-280全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司)檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)，已糖激酶法檢測空腹血糖(FPG)。采用ML-dr3518酶標(biāo)分析儀(上海酶聯(lián)生物有限公司)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清TNF-α、IL-1β和IL-6。

1.3 預(yù)后影響因素分析 出院3個(gè)月后進(jìn)行格拉斯哥預(yù)后(GOS)評分，死亡為1分，植物生存狀態(tài)為2分，遺留重度殘疾為3分，遺留輕度殘疾為4分，可正常生活為5分[9]。根據(jù)GOS評分將患者分為預(yù)后良好組(>4分，87例)，預(yù)后不良組(≤4分，80例)。收集HICH患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓家族遺傳史、基礎(chǔ)疾病、并發(fā)癥、腦出血部位(基底核區(qū)、丘腦、腦室、小腦及腦干)、血腫量[根據(jù)田式公式：π/6×長(cm)×寬(cm)×高(cm)計(jì)算]、GCS評分、SSS評分[7]、治療方式(血腫清除手術(shù)、去骨瓣減壓術(shù)、保守治療)、收縮壓、舒張壓、血清炎性因子水平以及miR-141-3p、miR-29a-3p水平等臨床資料，比較預(yù)后良好組與預(yù)后不良組臨床資料差異，分析影響HICH預(yù)后的相關(guān)因素。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比較 HICH組血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于對照組(P均<0.01)，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 HICH組、對照組血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比較

2.2 不同病情嚴(yán)重程度患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比較 重型組血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于中型組和輕型組，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于中型組和輕型組(P均<0.01)；中型組血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于輕型組，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于輕型組(P均<0.01)。見表2。

2.3 HICH組血清miR-141-3p、miR-29a-3p與炎癥因子的相關(guān)性 HICH組血清miR-141-3p水平與TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.603、-0.510、-0.571，P均<0.01)，血清miR-29a-3p水平與TNF-α、IL-1β、IL-6水平亦呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.531、-0.432、-0.605，P均<0.01)。

表2 不同病情嚴(yán)重程度患者血清miR-11-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比較

2.4 HICH預(yù)后的影響因素分析結(jié)果 預(yù)后不良組年齡、血腫量、SSS評分、收縮壓、血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于預(yù)后良好組，GCS評分、血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于預(yù)后良好組，兩組出血部位分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表3。將上述具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異項(xiàng)目納入回歸方程，因變量設(shè)為HICH預(yù)后(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)，ENTER法篩選變量，入α=0.05，出α=0.10，最終高收縮壓、小腦及腦干出血是HICH預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，高水平miR-141-3p、miR-29a-3p是HICH預(yù)后的保護(hù)因素(P均<0.01)，見表4。

2.5 miR-141-3p、miR-29a-3p對HICH預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值 miR-141-3p、miR-29a-3p預(yù)測HICH預(yù)后不良的截?cái)嘀捣謩e為1.03、1.25，曲線下面積分別為0.675、0688，兩者聯(lián)合預(yù)測HICH預(yù)后不良的曲線下面積為0.898，高于單獨(dú)指標(biāo)預(yù)測(Z分別為4.950、5.325，P均<0.01)，見表5。

表3 影響HICH預(yù)后的單因素分析結(jié)果

表4 影響HICH預(yù)后的Logistic回歸分析結(jié)果

表5 miR-141-3p、miR-29a-3p預(yù)測HICH預(yù)后不良的效能

圖1 miR-141-3p、miR-29a-3p預(yù)測HICH預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

腦出血是最致命的卒中類型，占所有卒中類型的10%～30%，高血壓是自發(fā)性腦出血的主要危險(xiǎn)因素，HICH發(fā)病30 d內(nèi)病死率為40%～50%[10]。目前HICH以降顱壓、開顱血腫清除、去骨瓣減壓等治療為主，尚缺乏有效的治療方法，探討與HICH有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)可為臨床治療提供新的方向和靶點(diǎn)，對預(yù)后評估亦有較高應(yīng)用價(jià)值。HICH后可繼發(fā)血腫周圍組織水腫、神經(jīng)元凋亡和壞死以及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等，其中神經(jīng)炎癥反應(yīng)以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征，持續(xù)炎癥反應(yīng)可引起和加重腦出血后繼發(fā)性損傷[11]。miRNA是長度為22～26個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝、凋亡、器官發(fā)育等病理生理過程，還可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化以及極化后炎癥反應(yīng)，與腦出血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2,12]。

miR-141-3p是具有抑制炎癥反應(yīng)作用的miRNA。研究表明miR-141-3p在自身免疫性心肌炎小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-141-3p表達(dá)可通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子4表達(dá)降低血清炎癥因子水平[13]；miR-141-3p還可通過下調(diào)下游靶基因高遷移率族蛋白B1抑制IL-1β、TNF-α和IL-6水平，緩解慢性炎癥性疼痛[14]；在壞死性小腸結(jié)腸炎miR-141-3p通過抑制受體相互作用蛋白激酶1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腸上皮細(xì)胞壞死性凋亡[15]。miR-141-3p與腦卒中后社會孤立也有關(guān)，抑制miR-141-3p表達(dá)可減輕腦卒中神經(jīng)功能缺損，縮小梗死體積，降低病死率[16]。但是miR-141-3p在腦出血的報(bào)道十分少見。本研究結(jié)果顯示miR-141-3p在HICH患者血清中表達(dá)下調(diào)，且隨著神經(jīng)損傷加重而降低，是HICH患者預(yù)后不良的影響因素，說明miR-141-3p在HICH中作用機(jī)制與帕金森病和缺血性腦卒中不同，miR-141-3p似乎在HICH發(fā)病過程中發(fā)揮保護(hù)作用。李曉波等[4]報(bào)道也指出，miR-141-3p在腦出血患者血清中水平下調(diào)，miR-141-3p水平與腦出血血腫嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，本研究與其結(jié)論一致。miR-141-3p在HICH的作用機(jī)制尚不清楚，miR-141-3p可能通過靶向NLRP3基因表達(dá)抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18水平，降低炎癥反應(yīng)及其介導(dǎo)的神經(jīng)組織損傷[4]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-141-3p水平與IL-1β、TNF-α和IL-6呈負(fù)相關(guān)，說明miR-141-3p水平缺失可能加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致HICH病情進(jìn)展。

miR-29a-3p作為一種腫瘤抑制因子備受腫瘤學(xué)界的關(guān)注，已知可通過調(diào)控靶基因表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[17-18]。miR-29a-3p在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也出現(xiàn)異常表達(dá)，且發(fā)揮不同作用機(jī)制，現(xiàn)有報(bào)道顯示miR-29a-3p在正常腦組織中高表達(dá)，通過靶向ROBO1的3′-UTR抑制軸突導(dǎo)向受體蛋白1表達(dá)，繼而抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成擬態(tài)形成，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移[19]。miR-29a在阿爾茨海默病患者腦脊液中表達(dá)增加，被認(rèn)為是阿爾茨海默病的候選生物標(biāo)志物[20]，而血管性癡呆患者血漿miR-29a-3p水平下調(diào)，miR-29a-3p水平與認(rèn)知水平呈負(fù)相關(guān)[21]，體外研究則顯示miR-29a-3p通過靶向開放閱讀框72基因抑制阿爾茨海默病模型細(xì)胞凋亡，促使其存活[22]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p在HICH患者血清中水平下調(diào)，低水平miR-29a-3p與HICH病情加重以及預(yù)后不良均有關(guān)，表明miR-29a-3p可能在HICH中發(fā)揮保護(hù)作用。分析可能的機(jī)制為miR-29a-3p表達(dá)缺乏可能導(dǎo)致其靶基因Ⅰ型膠原蛋白α2鏈表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促使顱內(nèi)動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白沉積，降低血管壁彈性，導(dǎo)致血管破裂出血[23]。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),miR-29a-3p與IL-1β、TNF-α和IL-6呈負(fù)相關(guān)，表明miR-29a-3p參與HICH炎癥反應(yīng)過程，推測miR-29a-3p表達(dá)缺失可能誘導(dǎo)炎癥因子大量釋放，放大炎癥反應(yīng)，加速血腦屏障破壞和腦水腫嚴(yán)重程度，繼而加重神經(jīng)系統(tǒng)損傷。miR-29a-3p對炎癥因子調(diào)節(jié)可能通過靶向調(diào)控其下游基因Kruppel樣因子4(KLF4)實(shí)現(xiàn)，miR-29a-3p表達(dá)缺失，KLF4表達(dá)上調(diào)，KLF4過表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性因子TNF-α、IL-10、單核細(xì)胞集落刺激因子等炎性介質(zhì)產(chǎn)生，加速動(dòng)脈管壁硬化進(jìn)程[23]，導(dǎo)致動(dòng)脈破裂出血和神經(jīng)損傷。

通過ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p、miR-29a-3p均具有一定預(yù)測HICH預(yù)后的效能，但是單獨(dú)使用預(yù)測效能不理想，聯(lián)合兩項(xiàng)指標(biāo)后預(yù)測效能有所提高，提示聯(lián)合miR-141-3p、miR-29a-3p可為HICH患者預(yù)后評估提供輔助參考信息。回歸分析結(jié)果顯示高收縮壓、小腦及腦干出血與HICH患者預(yù)后也存在密切關(guān)系，分析為收縮壓越高血管破損程度越重，出血量越多，神經(jīng)損傷越重；小腦及腦干出血尤其是腦干部位出血直接影響人體心跳和呼吸等重要生理功能，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1]。

綜上可見，HICH患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平均降低，低水平miR-141-3p、miR-29a-3p與HICH患者神經(jīng)損傷程度加重以及預(yù)后不良均有關(guān)，低水平miR-141-3p、miR-29a-3p可能通過促使炎癥反應(yīng)參與HICH發(fā)病和進(jìn)展過程。本研究局限之處在于尚未能直接證實(shí)miR-141-3p、miR-29a-3p在HICH發(fā)病機(jī)制中的作用，這仍待進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究證實(shí)。