不同血液凈化方式對慢性腎功能衰竭患者樹突狀細胞和血小板活化標志物表達的影響

張盛，雷莉，韓林，胡大軍

慢性腎功能衰竭是機體腎臟病變的嚴重表現，病變會呈無法逆轉的進展，后期會導致機體多臟器或系統受累，嚴重影響患者生活質量，甚至威脅患者生命安全[1]。血液凈化是治療慢性腎功能衰竭的主要方法，隨著替代治療血液凈化技術的逐漸進步，慢性腎功能衰竭患者的病死率得到明顯控制[2]。當前應用于臨床的血液凈化方式主要有血液透析(hemodialysis，HD)、血液透析濾過(hemodiafiltration，HDF)和血液灌流(hemoperfusion，HP)3種，其中HP出現最早，應用最廣泛，HDF、HP從應用于臨床后一直顯現出較高的治療價值[3-5]。但既往研究中多為對比其中2種方法治療慢性腎功能衰竭的效果差異，或對比2種方法聯合應用與1種方法單一應用的效果與安全性差異[6-7]，在同一項研究中對比HD、HDF、HP 3種方法治療慢性腎功能衰竭的效果報道偏少。基于此，本研究分析了HD、HDF、HP 3種血液凈化方式對慢性腎功能衰竭患者樹突狀細胞和血小板活化標志物表達的影響，旨在為慢性腎功能衰竭患者血液凈化方式的選擇提供參考依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1—12月湖北省宜昌市第二人民醫院腎內科收治慢性腎功能衰竭患者106例，以隨機數字表法分為HD組36例，HDF組35例，HP組35例。HD組男20例，女16例，年齡45～71(54.91±8.95)歲；病程1～5(2.94±1.43)年；原發疾病：慢性腎盂腎炎2例，狼瘡性腎炎4例，高血壓腎病7例，糖尿病腎病9例，慢性腎小球腎炎12例，其他2例。HDF組男19例，女16例，年齡43～73(56.53±8.47)歲；病程1～5(2.84±1.27)年；原發疾病：慢性腎盂腎炎1例，狼瘡性腎炎3例，高血壓腎病8例，糖尿病腎病9例，慢性腎小球腎炎11例，其他3例。HP組男20例，女15例，年齡44～73(55.48±9.24)歲；病程1～6(3.01±1.29)年；原發疾病：慢性腎盂腎炎2例，狼瘡性腎炎3例，高血壓腎病6例，糖尿病腎病10例，慢性腎小球腎炎11例，其他3例。3組性別、年齡、病程、原發疾病比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(倫批號：KYLL20200110)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合“慢性腎衰竭中西醫結合診療指南”[8]中的診斷標準；②年齡>18歲，性別不限；③具備血液凈化適應證；④病情處于穩定期；⑤胃腸功能、營養水平正常。(2)排除標準：①合并急性或慢性感染者；②合并凝血功能異常者；③伴有心、肝、肺等臟器功能嚴重障礙者；④存在精神異常或溝通障礙者；⑤嚴重低血糖發作與酮癥酸中毒者。

1.3 治療方法 (1)HD組：選擇Fresenius F80B聚砜血液透析器(德國費森尤斯集團)及碳酸氫鹽透析液，流量 500 ml/min，傳統抗凝，透析每周進行3次，每次持續4 h，透析血流量220～250 ml/min。(2)HDF組：選擇Polyflux 11S高通量一次性血濾器[金寶腎護理產品(上海)有限公司北京辦事處]，每周進行1次HDF及2次HD，每次持續4 h。選擇后置換方式完成濾過，經血透機(德國，費森尤斯4008S)在線生成置換液，置換液流量70～110 ml/min，總量保持在18～30 L;血流量控制在220～250 ml/min。選擇肝素鈉注射液抗凝，合并出血傾向者給予低分子肝素鈣注射液抗凝。(3)HP組：采取組合型人工腎方式進行血液凈化，即間隔2周實施HP 1次及HD 5次，同樣每次持續4 h。選擇HA130一次性使用樹脂血液灌流器(珠海健帆生物科技股份有限公司)行HP，在透析器之前串聯好灌流器。血流量220 ml/min，每次灌流2 h，取下灌流器后，繼續行HD治療4 h。合并出血傾向的患者給予低分子肝素鈣注射液抗凝。3組均治療6個月。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 相關生化指標檢測：于治療前(治療開始前1天)、治療后(治療6個月結束后第1天)抽取患者肘靜脈血3 ml，離心留取上層血清待測。以7180型全自動生化分析儀(株式會社日立制作所)檢測血清白蛋白(Alb)、血紅蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)，所有操作均嚴格依據說明書及相關規程進行；全定量酶聯免疫測定法測定β2- 微球蛋白(β2-MG),放射免疫法測定瘦素(leptin，LEP)水平，試劑盒均購自上海酶研生物科技有限公司。

1.4.2 樹突狀細胞標志物檢測：于治療前、治療后，抽取患者外周血15 ml稀釋后加在淋巴細胞分離液表面，離心收集外周血中單個核細胞，依據1×106細胞/cm2接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液，放在5%CO2、37℃的培養箱中進行培養，4 h之后將貼壁細胞加入100 ng/ml粒細胞單核細胞集落刺激因子、白介素-4 50 ng/ml后繼續進行培養，間隔1天換1次液，密切監測細胞生長情況，至第7天時加入100 ng/ml 腫瘤細胞壞死因子-α，再隔1天后進行細胞收集，得到成熟樹突狀細胞。之后將收集到的細胞借助FACS標記液懸浮為5×106/ml，抽取100 μl置于離心管，按照1∶10比例稀釋PE熒光標記的抗體，混勻細胞后在4℃下孵育0.5 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，再次進行懸浮處理，通過CytoFLEX LX型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)進行CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86水平測定。

1.4.3 血小板活化標志物檢測：于治療前、治療后抽取患者肘正中靜脈血4 ml，3.8%枸緣酸鈉抗凝，提取其中的血小板成分200 μl，離心分離上清液，每管血小板中加入1%牛血清ALB 100 μl，CD62P-PE、血小板顆粒膜糖蛋白-140(GMP-140)、CD61、CD63-647、P10一抗(上海華盈生物醫藥科技有限公司)5 μl，4℃下孵育0.5 h，間隔15 min振蕩1次；加入PBS 1 ml，再離心處理，除去上清液；選擇PBS 1 ml洗滌， 離心同樣除去上清液；加入PBS 300 μl重懸，并在0.5 h內利用CytoFLEX LX型流式細胞儀檢測3組GMP-140、CD61、CD62P、CD63、P10水平。

1.4.4 記錄透析相關并發癥：記錄不同血液凈化治療6個月期間患者肌肉痙攣、皮膚瘙癢、血壓異常(低血壓或高血壓)、心律失常、心力衰竭、心絞痛的發生率。

1.5 療效評價標準 根據血液凈化模式選擇專家共識[9]中的相關標準進行評估。(1)顯效：慢性腎功能衰竭相關癥狀均消失，毒性物質清除率>95%；(2)好轉：慢性腎功能衰竭相關癥狀明顯減輕，毒性物質清除率在60%～95%；(3)無效：慢性腎功能衰竭相關癥狀仍明顯甚至加重，毒性物質清除率<60%。總有效率=(顯效+好轉)/總例數×100%。

2 結 果

2.1 3組臨床療效比較 HDF組、HP組治療總有效率明顯高于HD組(P<0.05)，HDF組、HP組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組臨床療效比較 [例(%)]

2.2 3組治療前后相關生化指標比較 治療前3 組Alb、Hb、BUN、SCr、β2-MG、LEP水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6個月后，3組BUN、SCr、β2-MG水平明顯低于治療前，HDF組、HP組Alb、Hb高于治療前，差異均有統計學意義(P<0.05)；HDF組、HP組Alb、Hb水平均高于HD組，β2-MG、LEP低于HD組(P<0.05)，3組BUN、SCr比較差異無統計學意義(P>0.05)，HDF組、HP組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 3組治療前后樹突狀細胞標志物水平比較 治療前，3組CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6個月后，HD組各指標均升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，HDF組、HP組各指標水平均高于治療前，且高于HD組(P<0.05)， 而HDF組、HP組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4 3組治療前后血小板活化標志物水平比較 治療前，3組GMP-140、CD61、CD62P、CD63、P10比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6個月后，HD組各指標均下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，HDF組、HP組各指標水平均低于治療前，且低于HD組(P<0.05)， 而HDF組、HP組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.5 3組透析相關并發癥比較 HDF組、HP組透析相關并發癥發生率明顯低于HD組(χ2=10.303，P=0.006)，HDF組、HP組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表2 3組治療前后生化指標水平變化比較

表3 3組治療前后樹突狀細胞標志物水平變化比較

表4 3組治療前后血小板活化標志物水平變化比較

表5 3組血液凈化期間透析相關并發癥發生率比較 [例(%)]

3 討 論

臨床進行血液凈化治療的方法主要有HD、HDF、HP 3種，3種方法的作用機制各有不同，其中HD機制為彌散性清除血液中有害成分，HDF主要機制為對流與部分吸附，HP的機制則為吸附清除血液中有害物質。且針對物質不同，也影響清除方式的選擇，一般中分子、大分子主要使用對流與吸附清除法，對于小分子物質，可首選彌散清除法[10]。近些年不少研究證實，相較于常規HD，選擇HDF與HP方法對大分子物質的清除可獲得更好的效果[11]。本研究則主要就HD、HDF、HP 3種血液凈化方式進行單一應用效果的對比，以期為慢性腎功能衰竭的血液凈化方法選擇提供一定參考。苗暢賢等[12]研究中對比HD聯合HDF(A組)、HD聯合HP(B組)的效果差異，顯示A組不良反應發生率明顯高于B組，與本結果不一致，考慮是由于本研究進行的是HD、HDF、HP對比，而該研究中各組患者治療中分別聯合應用了HDF、HP方法，研究對照方案不同加上納入對象基本情況的差異使得治療安全性上不可避免表現出一定差異，這也是本研究不同于既往臨床報道結果的方面，體現了本研究中對于HDF、HP這2種透析治療方法應用價值的深入發掘，也為今后血液凈化治療方案的選擇提供了參考思路。

LEP是尿毒癥的中分子毒素之一，對機體能量代謝會產生影響，引發營養不良。LEP是慢性腎衰尿毒癥患者死亡的獨立影響因素，常規HD無法有效清除LEP，需要使用清除毒素作用更強的HD濾過及灌流[13]。β2-MG濃度過高容易導致患者出現透析相關性淀粉樣變，患者會有多種并發癥表現，通過行HDF、HP可以有效清除β2-MG，因而能明顯降低并發癥發生率[14]。本研究治療6個月后相較于HD組，HDF組、HP組Alb、Hb水平更高，β2-MG、LEP水平更低，后2組上述指標水平比較差異均無統計學意義，而治療后3組BUN、SCr水平均未顯示出明顯波動。可知慢性腎功能衰竭患者通過接受血液凈化治療，大部分生化指標水平均會發生波動，其中蛋白水平表現出升高變化，β2-MG、LEP則表現出降低變化，BUN、SCr水平不受血液凈化治療的明顯影響。HDF組、HP組治療后各指標無明顯差異表明2種治療方法效果接近。HD的原理主要是利用超濾、半透膜的溶質彌散作用，可有效清除小分子尿毒素，本研究HD治療維持3次/周的頻率，屬于間歇式透析治療，期間如果患者體質量明顯增加，短期內超濾量大，則容易影響血流動力學穩定性，導致血壓下降，或由于腎素—血管緊張素系統被過度激活，引起血壓升高、心肌缺血，但如果采取補鹽的方式以期改善以上不良反應，又會導致水鈉潴留。相比之下，HDF與生理狀態更為接近，可使血流動力學更穩定，主要是由于其原理為等滲清除血液中的鈉、氯，對保持細胞高滲狀態，加快細胞內液轉移到細胞外間隙具有重要意義。另外，HP吸附面積大、速率快，相對吸附特異性明顯，能吸附分子量較大的物質，因此可有效清除LEP、β2-MG[15]。另有類似研究也顯示，治療中應用HP的患者β2-MG水平降低更明顯，與本研究結論一致[16]。

樹突狀細胞是機體中功能最強的抗原遞呈細胞，同時是機體中唯一可激活初始T細胞的抗原遞呈細胞，可在缺乏刺激因子的情況下啟動機體免疫反應，由此可知，樹突狀細胞是機體免疫應答的始動者，在激活T細胞介導的免疫應答中價值突出[17]。本研究從患者樹突狀細胞分化抗原的表達水平角度進行了深入細致的研究，結果進一步佐證了HDF、HP 2種透析治療方法在慢性腎功能衰竭患者中的應用價值，這與既往報道的結果基本一致。吳俊逸等[18]研究顯示，終末期腎病患者CD83、CD86表達與健康對照組無明顯差異，因此將其作為血液凈化療效評價指標價值不明顯，與本研究結論有異，考慮與納入對象基本特征差異、透析方式差異、檢測方式差異有關。慢性腎功能衰竭患者血液高凝狀態比較明顯，血小板作為凝血重要指標，可準確反映凝血功能，因此慢性腎功能衰竭患者血小板相關指標表達會異常升高，通過治療其水平得以下降證實治療有效性。血小板活化被視為血栓形成的重要原因，檢測活化血小板水平是進行血栓形成監測的重要方法，常見的血小板活化標志物主要有GMP-140、CD61、CD62P、CD63、P10等。本研究3組治療前GMP-140、CD61、CD62P、CD63、P10水平差異均無統計學意義，HD組治療前后各指標差異無統計學意義，HDF組、HP組治療后各指標均低于治療前；HDF組、HP組各指標水平均低于HD組(P<0.05)，但HDF組、HP組差異無統計學意義(P>0.05)，表明HD治療后血小板活化標志物表達不會呈現出明顯波動，而HDF、HP方式則會引起血小板活化標志物表達的明顯減低，與相關研究一致[19]。

綜上，3種血液凈化方式治療慢性腎功能衰竭患者均有效果，相比HD，HDF、HP的應用可獲得更高總有效率，可減少并發癥，調節生化指標、樹突狀細胞標志物、血小板活化標志物水平，HP、HDF 2種方法比較差異不大，臨床可在HP、HDF中視情況選擇。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張盛：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;雷莉：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;韓林：進行統計學分析；胡大軍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核