AK092375通過膀胱癌GLUT3的表達對NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關因子的影響

黃勇，易發現，任超，張宏，寶詩琪，閆駿

膀胱癌是臨床較為常見的一種泌尿系惡性腫瘤，易出現轉移和復發，對患者預后產生較為嚴重的影響[1]。為明確膀胱癌發生發展的相關機制，臨床一直致力于治療靶標和診斷標志物的研究。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種來自于人體本身，但長度小于200 kb且不具有編碼功能的RNA[2]。多項臨床研究顯示[3-4]，腫瘤的發生和發展過程中均有lncRNA的參與;同時大量lncRNA被證實在非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌等惡性生物學過程中起著重要的作用。有研究發現，AK092375在肌層浸潤性膀胱癌組織和非肌層浸潤性膀胱癌組織中過表達，而在正常膀胱黏膜中不表達或低表達[5]。然而，高表達的AK092375如何導致膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲能力增強仍不清楚[6]。為此，應用基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)軟件分析了與AK092375轉錄相關的共表達基因和侵襲轉移相關的信號通路，表明葡萄糖轉運蛋白3(GLUT3)的表達及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路在膀胱癌細胞進展中起著一定作用[7]。現探究lncRNA AK092375在膀胱癌細胞中的表達情況，并分析AK092375通過GLUT3的表達對NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關因子的影響，為膀胱癌的發生、發展機制提供新的方向和思路，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：人膀胱癌細胞系T24、人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1。(2)試藥及試劑：鼠抗NF-κB單克隆抗體、鼠抗TCS2單克隆抗體、鼠抗mTOR單克隆抗體、鼠抗AK092375單克隆抗體、鼠抗GLUT3單克隆抗體均購于北京普利萊基因技術有限公司；胎牛血清和RP-MI1640培養基購于上海基因科技有限公司，RNA提取試劑購于廣州賽百純生物科技有限公司；AK092375 siRNA、GLUT3 siRNA、AK092375全長序列的過表達載體(pcDNA-AK092375)、GLUT3全長序列的過表達載體(pcDNA-GLUT3)和RT-PCR引物購于上海北諾生物科技有限公司。(3)儀器設備：iMark酶標儀(上海科華實驗系統有限公司，ST-360型)；PCR擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司，A700型)；BPN-40 RHP型二氧化碳培養箱(蘇州貝茵醫療器械有限公司);顯微鏡(蘇州西默醫療科技有限公司,DOM3000A型)。

1.2 實驗方法 2020年1月—2021年5月于內蒙古醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心進行相關實驗。

1.2.1 細胞培養：將人膀胱癌細胞系T24和人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1于含有10%雙抗和胎牛血清的培養液(RP-MI1640)中進行常規培養，細胞培養箱充予5%CO2、維持37℃，隔天更換培養液，待細胞融合到90%左右時，即可進行傳代；而后隨機分為A組(AK092375和GLUT3同時過表達)、B組(AK092375和GLUT3同時干擾)、C組(AK092375過表達而GLUT3干擾)、D組(AK092375干擾而GLUT3過表達)4組。

1.2.2 細胞轉染：將上述培養生長良好的T24細胞進行計數后，置于多個6孔培養板中進行接種，待細胞匯合處于70%左右時，即可進行轉染處理。其中A組進行40 nmol/L的pcDNA-AK092375、pcDNA-GLUT3轉染；B組進行40 nmol/L的AK092375 siRNA、GLUT3 siRNA轉染；C組進行40 nmol/L的pcDNA-AK092375、GLUT3 siRNA轉染；D組進行40 nmol/L的AK092375 siRNA、pcDNA-GLUT3轉染。4組孵育48 h后分別收集培養好的細胞，以備后續實驗。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 Western-blot檢測細胞蛋白表達[8]：收集各組部分轉染培養好的細胞，進行細胞蛋白提取、含量測定，而后將其置于SDS-PAGE膠中，在130 V條件下進行2 h的電泳處理；通過濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上；在室溫條件下，以Tris緩沖液(含有5%脫脂奶粉)處理PVDF膜1 h，裁剪完成后與一抗混合，在4℃條件下，孵育過夜；采用TBST對上述膜清洗8 min，重復操作4次，加入二抗(經辣根過氧化物酶標記)，之后在室溫條件下孵育2 h；采用TBST對上述膜清洗8 min，重復操作4次，最后通過ECL試劑盒對GLUT3及NF-κB、TCS2、mTOR蛋白表達情況進行檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測細胞mRNA表達[9]：收集各組部分轉染培養好的細胞，將Trizol試劑加入其中，提取細胞RNA，并對其完整性進行鑒定，通過說明書建立PCR反轉錄體系，之后再進行定量PCR反應，反應條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸處理30 s，共進行40個循環，引物序列見表1。PCR擴增之后，進入數據分析界面，內參以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為準，通過2-ΔΔCt法對AK092375、GLUT3及NF-κB、TCS2、mTOR目的基因表達量的相對值進行計算。

表1 相關基因表達的PCR引物序列

1.3.3 CCK-8試劑盒檢測細胞增殖水平[10]：將轉染4 h后的各組細胞取出，向其中加入CCK-8溶液10 μl，再常規培養4 h，以iMark酶標儀于波長450 nm處測定光密度值(OD)，細胞增殖能力以OD450表示。

1.3.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力[11]：完成轉染48 h以后，取出生長良好的各組膀胱癌細胞，置于6孔板中，并在其底面劃出均勻寬度的線條。當細胞培養融合度達到95%時，用磷酸鹽緩沖液沖洗1次，之后采用移液槍槍頭進行劃痕處理；再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，將其置入到無血清的培養基中，進行24 h的常規培養，最后通過顯微鏡拍照進行細胞遷移率的統計。

2 結 果

2.1 AK092375和GLUT3蛋白在不同細胞系中的表達比較 以GAPDH為參照，在人膀胱癌細胞系T24中AK092375和GLUT3蛋白的表達量明顯高于人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1(t/P=3.215/<0.001、2.538/<0.001)，見圖1。

注：A.人膀胱癌細胞系T24細胞；B.人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1

2.2 各組膀胱癌細胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關mRNA表達比較 GLUT3、NF-κB、TCS2、mTOR基因mRNA表達水平比較，A組>D組>C組>B組，且各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組膀胱癌細胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關mRNA表達比較

2.3 各組膀胱癌細胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關蛋白表達比較 GLUT3、NF-κB、TCS2、mTOR蛋白表達水平比較，A組>D組>C組>B組，且各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

2.4 各組膀胱癌細胞增殖和遷移情況比較 膀胱癌細胞遷移率和增殖情況比較，A組>D組>C組>B組，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 各組膀胱癌細胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關蛋白表達比較

圖2 各組膀胱癌細胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號通路相關蛋白表達比較

3 討 論

膀胱癌病因學研究認為，膀胱癌的發病與基因異常及外界危險因素侵襲有關，其中遺傳學研究涉及的分子改變包括染色體的不穩定性、表觀遺傳沉默及腫瘤抑癌基因的改變等[12]。近年來，表觀遺傳機制在惡性腫瘤中的作用受到關注，因為越來越多的證據表明表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重

構、RNA干擾等的異常在細胞腫瘤惡變行為中起到了重要作用[13]。在各種表觀修飾中，以非編碼形式存在的RNA可能在膀胱癌中具有特殊的意義[14]。非編碼RNA(ncRNA)是指由基因轉錄形成但不編碼蛋白質的RNA。人類基因組中98%的轉錄產物為ncRNA，其中具有調節作用的ncRNA包括短鏈RNA(如microRNA、siRNA等)和lncRNA[15]。過去10年研究積累的證據表明，lncRNA是基因表達重要的調控因子，在許多人類惡性腫瘤(如前列腺癌、膀胱癌和腎癌)中特異的lncRNA功能改變促進腫瘤的形成、進展、轉移，組織特異性表達的lncRNA可能作為非侵入性預后或治療判定的標志物[16]。通過研究lncRNA在正常和惡性細胞中的功能，更好地了解lncRNA分子的性質和機制，從而更好地了解腫瘤的生物學特征，為泌尿系統腫瘤的治療提供新靶點。

本結果顯示，AK092375和GLUT3蛋白在T24細胞系中呈現高水平表達，表明AK092375和GLUT3可能參與了膀胱癌的發生發展過程。有研究顯示[17]，AK092375在肌層浸潤性膀胱癌組織和非肌層浸潤性膀胱癌組織中過表達，而在正常膀胱黏膜中不表達或低表達。而GLUT3是細胞膜上跨脂質雙分子層、參與細胞外葡萄糖向細胞內轉運的載體蛋白，GLUT3高表達后可提高糖酵解的速率和增加葡萄糖的攝取[18]?，F已發現GLUT3在人類乳腺癌、肺癌、結腸癌、睪丸癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達，且高表達的GLUT3與預后不良有關[19]。研究表明AK092375和GLUT3的過表達程度越高，膀胱癌細胞的NF-κB、TCS2、mTOR的mRNA和蛋白表達水平也越高[20]。上皮間充質轉化(EMT)是腫瘤在產生侵襲時重要的一種機制，而GLUT3可促進癌細胞EMT，進而影響細胞的增殖、侵襲與轉移。GLUT3也可通過調節NF-κB、TCS1/2基因的表達，從而激活NF-κB/TCS/mTOR信號通路，促進腫瘤的形成[21]。NF-κB是對機體血管生成、細胞凋亡生長進行調節的一種關鍵性轉錄因子，其通路被激活后可廣泛參與多種病理和生理過程的基因調控，在腫瘤和炎性反應的發生發展過程中作用顯著[22]。mTOR是一種參與調節細胞生長增殖及蛋白質翻譯的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，具有高度的保守性。mTOR通路包含一系列相關的蛋白和底物，其可對磷酸化蛋白激酶B(Akt)、PI3K依賴的激酶1(PDK1)的表達進行調節[23]。相關研究顯示[24]，mTOR通路相關因子的異常表達，可導致心血管疾病及腫瘤等重大疾病。在卵巢癌、乳腺癌及膀胱癌等惡性腫瘤中，Akt/PI3K信號通路被激活后，可將信號通過NF-κB、mTOR的高表達向下游底物進行傳遞，進而對CDK4抑制劑的表達產生抑制效果，進而使細胞周期加速。另外，NF-κB還可對腫瘤生長相關的多種細胞因子產生影響，進而對相關蛋白表達進行調控，促進腫瘤細胞分化和增殖。故mTOR通路和NF-κB通路兩者產生協同作用，進而促進腫瘤細胞的增殖和遷移。

表4 各組膀胱癌細胞遷移率和增殖情況比較

綜上所述，AK092375可能通過上調GLUT3的表達，從而激活下游NF-κB/TCS2/mTOR信號通路，進而促進膀胱癌細胞的增殖和轉移，具有一定的臨床參考價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃勇：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；易發現：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;任超、寶詩琪：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;張宏：進行統計學分析;閆駿：課題設計，論文撰寫