皮膚鱗狀細胞癌中miR-383-5p、KIF3B mRNA的表達及臨床意義

黃永初，張小超，朱小美，詹娟

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是一種常見的非黑素瘤皮膚癌，占所有皮膚癌的20%～50%，是非黑素瘤皮膚癌患者死亡的主要原因[1]。 腫瘤是由多因素、多基因介導的過程，微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小RNA，能通過結合目標RNA互補片段，調控癌基因與抑癌基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[2]。研究報道，miR-383-5p在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達，參與癌細胞增殖、遷移、侵襲等行為[3-4]。細胞異常分裂是腫瘤發(fā)生重要原因之一，驅動蛋白家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)為細胞分裂驅動蛋白家族一員，其過度表達將導致細胞異常分裂，研究報道，KIF3B參與胃癌、骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[5-6]。目前尚不明確miR-383-5p、KIF3B與cSCC的關系，本研究旨在分析cSCC癌組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達與病理參數(shù)的關系，以期為cSCC診斷和治療提供一種新的策略，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2021年8月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院皮膚科收治手術切除cSCC患者49例，其中男26例，女23例，年齡42～82(60.25±8.66)歲；發(fā)病部位：頭面部41例，肢體4例，軀干4例；皮損直徑：≥5 cm 9例，<5 cm 40例；分化程度：低分化17例，中高分化32例；TNM分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期14例；侵襲程度：淺表20例，深部29例；有淋巴結轉移11例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①經(jīng)術后病理檢查確診為cSCC；②初次確診，術前未接受任何內分泌、放化療者；③臨床資料完整者；④可接受隨訪者。(2)排除標準：①合并其他部位腫瘤者；②嚴重心、肝、腎等臟器疾病者；③全身感染性疾病者；④妊娠期及哺乳期女性。

1.3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達檢測 手術切除癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm)，剪碎后研磨，使用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織中總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Takara逆轉錄試劑盒轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR擴增。miR-383-5p上游引物：5′-TCGGTGTTAGTGGAAGACTAGAC-3′，下游引物：5′-GTCTAGTCTTCCACTAACACCGA-3′；KIF3B上游引物：5′-GATGTTAAGCTGGGGCAGGT-3′，下游引物：5′-TTTGCCGTCCACTAGAGCAG-3′；miR-383-5p內參U6上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物：5′-AATATGGAACGCTTCACGAAT-3′；KIF3B內參GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應體系(共10.0 μl)：SYBR Premix Ex Taq 5.0 μl,引物0.2 μl, ROX Reference Dye 0.2 μl, cDNA模板1.0 μl, RNase-free ddH2O 3.4 μl。反應條件：95℃ 90 s (1個循環(huán))，95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(40個循環(huán))，反應結束后得到各反應管Ct，組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2 結 果

2.1 cSCC癌組織和癌旁組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達比較 cSCC癌組織中miR-383-5p表達明顯低于癌旁組織，KIF3B mRNA表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表1。

表1 cSCC癌組織和癌旁組織中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達比較

2.2 cSCC組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達的相關性 http://starbase.sysu.edu.cn/網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)，KIF3B的3' -非翻譯區(qū)659～665堿基處存在與miR-383-5p的潛在結合位點，見圖1。Pearson相關性分析顯示，cSCC組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達呈負相關(r=-0.573，P<0.001)。

2.3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達在cSCC患者不同臨床/病理參數(shù)中比較 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達在cSCC患者不同TNM分期、侵襲程度、淋巴結轉移中比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而在不同性別、年齡、發(fā)病部位、皮損直徑、分化程度方面比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，見表2。

圖1 miR-383-5p與KIF3B結合位點示意圖

2.4 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達對cSCC發(fā)生的預測價值 ROC曲線顯示，miR-383-5p聯(lián)合KIF3B mRNA預測cSCC發(fā)生的AUC大于二者單獨預測(Z=2.936、3.220，P=0.003、0.001)，見表3、圖2。

3 討 論

cSCC是起源于附屬器角質形成細胞或表皮的惡性增殖性腫瘤，通常發(fā)生于陽光照射區(qū)域，以頭頸部較常見，目前cSCC的治療仍然以完全切除原發(fā)腫瘤為主，大多cSCC在手術切除后可以成功根除，但14%～15%的原發(fā)性cSCC患者存在亞臨床浸潤[8]。cSCC具備較強侵襲性，腫瘤細胞浸潤性生長可突破表皮基底膜，侵犯真皮深部、皮膚附屬器、血管、淋巴管、神經(jīng)等，發(fā)展為高危型cSCC，雖然近年來Mohs顯微描記手術和西米普利單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗等免疫和靶向治療藥物極大地改善了cSCC患者預后，但高危和極高危型cSCC預后仍然較差，5年復發(fā)率為30%～50%[9]。因此有必要進一步探索cSCC發(fā)生發(fā)展機制，識別更多治療靶點。

圖2 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達預測cSCC發(fā)生的ROC曲線

表2 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達與cSCC患者臨床病理參數(shù)的關系

表3 miR-383-5p、KIF3B mRNA表達對cSCC發(fā)生的預測價值

miRNA是一類內源性長18～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，能通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)結合，負反饋調節(jié)靶基因的表達，參與基因轉錄后水平調控，在包括cSCC在內多種腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能[10]。如miR-451a能通過3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1介導的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路抑制cSCC細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化[11]。miR-383-5p定位于人染色體8p22，近年多項研究均報道了其與惡性腫瘤的關系。Azarbarzin等[12]研究報道，miR-383-5p在乳腺癌中表達下調，能通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶標信號通路抑制程序性死亡配體1，進而抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和促進凋亡。Li等[13]研究報道，miR-383-5p在肝癌中表達下調，能靶向囊泡關聯(lián)膜蛋白2抑制肝癌細胞增殖和增強化療敏感性。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，cSCC癌組織中miR-383-5p表達降低，提示miR-383-5p低表達可能在cSCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究結果顯示，cSCC組織中miR-383-5p表達與患者TNM分期、侵襲程度、淋巴結轉移有關，說明miR-383-5p低表達參與cSCC發(fā)生發(fā)展，其機制可能與miR-383-5p能靶向抑制RNA結合基序蛋白3(RNA-binding motif 3，RBM3)表達有關。RBM3是一種富含甘氨酸的核糖核蛋白復合物，參與RNA轉錄后調控和翻譯，能通過調節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路、抑制G2/M期細胞數(shù)量、改變mRNA二級結構等多種途徑誘導腫瘤細胞增殖、增強腫瘤中激酶活性、抑制腫瘤細胞凋亡，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個原癌基因[14]。Wang等[15]研究報道，miR-383-5p能靶向抑制RBM3表達，從而抑制頭部、頸部鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲、遷移、上皮間質轉化和促進凋亡。

有絲分裂是細胞分裂主要方式，細胞分裂是指活細胞增殖數(shù)目由1個細胞分裂為2個細胞的過程，細胞分裂時會復制自身DNA以確保子代細胞DNA完整，若分裂過程中復制不全或DNA損傷則會引起癌變[16]。細胞分裂是由多個馬達驅動蛋白調控通路構成的復雜生命活動，驅動蛋白沿微管細絲的移動支持有絲分裂、減數(shù)分裂和細胞運輸?shù)榷喾N細胞功能[17]。KIF3B是驅動蛋白超家族一員，定位于人染色體20q11.21，參與調節(jié)細胞遷移和增殖，有絲分裂期間KIF3B負責囊泡運輸和膜擴張，從而調節(jié)細胞遷移。近年來多項研究也報道了KIF3B與惡性腫瘤的關系，如KIF3B在乳腺癌、結腸癌中表達上調，沉默KIF3B能通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路和上皮間充質轉化，從而抑制乳腺癌、結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[18]。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，cSCC癌組織中KIF3B表達升高，并與cSCC患者TNM分期、侵襲程度、淋巴結轉移有關，說明KIF3B高表達參與cSCC惡性進展，其機制可能為KIF3B過表達導致細胞分裂異常，促進cSCC發(fā)生和惡性進展。最后通過miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫Starbase預測發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p與KIF3B存在結合位點，相關性分析也顯示，cSCC癌組織中miR-383-5p與KIF3B mRNA表達呈負相關，說明miR-383-5p、KIF3B可能共同參與cSCC發(fā)生發(fā)展。林永麗等[19]通過雙熒光素酶基因也證實cSCC中miR-383-5p能靶向負調控KIF3B表達，抑制cSCC細胞增殖和誘導凋亡，進一步佐證了本研究結果。本研究ROC曲線顯示，miR-383-5p、KIF3B mRNA均能作為cSCC發(fā)生預測指標，且二者聯(lián)合預測cSCC發(fā)生的AUC大于單獨預測，說明聯(lián)合檢測miR-383-5p、KIF3B mRNA表達能提升cSCC發(fā)生預測價值。

綜上所述，cSCC組織中miR-383-5p低表達，KIF3B mRNA高表達，與TNM分期、侵襲程度、淋巴結轉移有關，二者可能共同參與cSCC發(fā)生發(fā)展，可作為cSCC發(fā)生預測指標。但本研究樣本量較少，關于miR-383-5p、KIF3B對cSCC的影響機制尚不完全明確，同時因隨訪時間較短，關于miR-383-5p、KIF3B與cSCC患者生存率和預后的相關性有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃永初：課題設計，實施部分試驗研究，論文修改和審核；張小超：實施部分試驗研究，論文撰寫；朱小美：資料搜集整理，分析試驗數(shù)據(jù)；詹娟：統(tǒng)計學分析