miR-29b調(diào)控HBP1信號(hào)通路與RA患者PBMs的關(guān)系

張 靜，崔國(guó)峰，劉 丹，李 娟★

（1. 西安市第五醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安 710082 ；2. 鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院骨科，河南 洛陽 471009）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種主要累及手足小關(guān)節(jié)的慢性全身性炎癥性疾病。RA 的特點(diǎn)是對(duì)稱的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，由于自身免疫性炎癥反應(yīng)集中在滑膜，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形（特別是掌指關(guān)節(jié)、近端指間關(guān)節(jié)）。外周血中CD14+、CD16+外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood monocytes，PBMs）的含量較小，僅占PBMs 的10% 左右。研究表明，在慢性炎癥性疾病（如RA）患者的外周血中，非經(jīng)典型PBMs 增加；在RA 患者的滑液中也發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典型PBMs 顯著增加，并且具有表型活性[1]。miR-29 家族是許多疾病中最常見的miRNAs。在本研究中，我們提供了miR-29b 通過抑制HBP1 信號(hào)通路增強(qiáng)RA 患者PBMs 對(duì)凋亡抵抗作用的證據(jù)支持，這有助于更好地理解轉(zhuǎn)錄后分子改變和全身性誘導(dǎo)RA 對(duì)凋亡抵抗之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2020 年6 月至2021 年12 月于西安市第五醫(yī)院就診的RA 患者（n=20）。其根據(jù)ACR 1987 年修訂的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)診斷RA 至少1 年，DAS 28 得分為（6.2±0.8）分；其中有女性15 例，男性5 例。

1.2 方法

使用ViaFect 試劑建立穩(wěn)定表達(dá)外源性HBP1 的THP-1 細(xì) 胞（THP-1/HBP1）， 用MISSION 轉(zhuǎn) 染 試劑將miR-29b 模擬物（miR-29b mimics）或模擬物陰性對(duì)照（mimics negative control，Mimics-NC）轉(zhuǎn)染PBMS 48 h。使用ProtoScript? Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）對(duì)RNA 樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用ABI Prism 7300 儀器和SYBR Green Reducts 進(jìn)行qPCR 分析。以18S RNA 或人U6 snRNA 為內(nèi)對(duì)照，采用2-△△CT 法比較不同靶點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。用于基因表達(dá)分析的引物如下：HBP1（基因登錄號(hào)NM_001244262.1）、CD14（基因登錄號(hào)NM_000591.4）、18S（基因登錄號(hào)M10098.1）。根據(jù)我們之前的工作進(jìn)行免疫印跡（Western blotting）處理。用兔抗-HBP1 和兔抗-β- 肌動(dòng)蛋白兩種不同的一抗進(jìn)行膜孵育。利用2.0 Dry-Down PCR 克隆試劑盒將人HBP1 3'-UTR 中假定的miR29b 結(jié)合位點(diǎn)DNA 片段（約1.1 kb）亞克隆到pGL4-Luc 報(bào)告載 體。 使 用QuikChange Site-Directed Mutagenesis試 劑 盒（Agilent，Santa Clara，CA，USA） 進(jìn) 行HBP1/3'-UTR 中miR-29b 結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變。對(duì)于報(bào)告基因的檢測(cè)，用ViaFect 將野生型報(bào)告基因結(jié)構(gòu)pGL4-Luc-HBP1/ 3'-UTR 或突變的報(bào)告基因結(jié)構(gòu)與miR-29b mimics 或Mimics-NC 一起轉(zhuǎn)染到5×106NIH/3T3 細(xì)胞。48 h 后，收集細(xì)胞，用熒光素酶報(bào)告試劑盒測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每次化驗(yàn)至少進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以Mean±S.E.M. 表示，使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用正態(tài)概率圖確定數(shù)據(jù)正態(tài)性，并根據(jù)需要使用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較。用Pearson's 線性回歸法分析參數(shù)之間的關(guān)系。P值＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

使用Target Scan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出20 個(gè)可能是miR-29b 潛在的靶點(diǎn)基因，其中HBP1 是一種與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選MiR-29b 潛在基因

在RA PBMs 中，HBP1 表達(dá)水平與miR-29b 的表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)性（n=20，P=0.0004，見圖2）。

圖2 HBP1 與PBMs 的miR-29b 表達(dá)負(fù)相關(guān)

無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平方面，在正常PBMs 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29b mimics 均顯著抑制HBP1的表達(dá)。見圖3。

圖3 miR-29b 增強(qiáng)對(duì)HBP1 抑制作用

野生型pGL4-HBP1 3'UTR-Luc（WT 組）報(bào)告質(zhì)粒和miR-29b mimics 共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶報(bào)告活性降低約48.7%，而突變的pGL4-HBP1 3'UTR-Luc（Mu 組）則消除了miR-29b 對(duì)熒光素酶報(bào)告活性的抑制。因此，HBP1 可以作為miR-29b 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接下游靶點(diǎn)。見圖4。

圖4 miR-29b 靶向HBP1 位點(diǎn)確定

3 討論

RA 在許多細(xì)胞類型中具有對(duì)凋亡的抵抗作用，包括T 細(xì)胞、RA-FLS 和PBMs。HBP1 是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織和細(xì)胞類型中參與多種細(xì)胞進(jìn)程，包括衰老誘導(dǎo)、凋亡調(diào)節(jié)、分化終止和腫瘤抑制[2]。HBP1 可從根本上調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的激活。例如，HBP1可通過抑制Mdm2 介導(dǎo)的p53 泛素化增強(qiáng)p53 的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[3]。p21 是p53 依賴的細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)。因此，HBP1 被認(rèn)為是一種有效的腫瘤抑制因子。在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（即顆粒細(xì)胞）中，顆粒特異性的HBP1 切除可導(dǎo)致小鼠顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)減少，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞生成，從而對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行調(diào)控[4]。

通過對(duì)PBMs 異位miR-29b 表達(dá)的分析，我們已經(jīng)確定HBP1 是潛在的下游靶點(diǎn)。用Pearson's 線性回歸分析確定RA 患者（n=20）PBMs 中miR-29b和HBP1 mRNA 水平之間的相關(guān)性（圖1）。并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-29b 可以與HBP1的3'UTR 直接結(jié)合（圖2）。重要的是，HBP1 的穩(wěn)定表達(dá)可以消除異位miR-29b 表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：HBP1的促凋亡作用在不同的系統(tǒng)中存在明顯差異，同時(shí)HBP1 的表達(dá)受表觀遺傳機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控[5-6]。包括miR-21、miR-19a 和miR-155 在內(nèi)的多種miRNA已被報(bào)道在轉(zhuǎn)化細(xì)胞和正常細(xì)胞中直接靶向HBP1的3'UTR。因此，我們目前的研究確定miR-29b 是PBMs 中HBP1 信號(hào)的直接上游調(diào)節(jié)因子。而miR-29b/HBP1 通路是否也在T 細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中起作用有待更深入的研究。

綜上所述，miR-29b 可與HBP1 結(jié)合，并具有抑制其在PBMs 中轉(zhuǎn)錄的作用。綜合分析研究結(jié)果可知，miR-29b 具有調(diào)控HBP1 信號(hào)通路改變RA 患者PBMs 對(duì)凋亡抵抗的作用。