腫瘤抑制因子CYLD和NF-κB信號(hào)通路與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系研究

雷 媛，杜 凌

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 柳州 545000）

潰瘍性結(jié)腸炎病變的主要特征為反復(fù)腹瀉、腹痛，臨床治愈難度非常大[1]。此疾病在各種人群中的發(fā)病率存在較大差異。北美及歐洲等地區(qū)的發(fā)病率較高，雖亞洲地區(qū)以往潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率較低，但近年受多種因素影響，其發(fā)病率也明顯增高[2]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，相比于普通人群，潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)生癌變的幾率明顯更高，且病情癌變現(xiàn)已成為潰瘍性結(jié)腸炎患者死亡的主要原因之一。潰瘍性結(jié)腸炎具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)、患者需終身服藥的特征[3]，且相關(guān)藥物價(jià)格高、治愈概率非常小，患者家庭和社會(huì)均需承受較重的負(fù)擔(dān)。因此，探索潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制和病因，為相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)和臨床治療提供方向具有迫切性。目前有關(guān)CYLD 介導(dǎo)NF-kB mRNA 的研究報(bào)道多偏向于分析癌性病變方向，很少關(guān)注到其在潰瘍性結(jié)腸炎病變中的介導(dǎo)作用。現(xiàn)本文納入2020 年8 月至2022年8 月廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院收治的58 例潰瘍性結(jié)腸炎患者和同期在該院接受體檢的55 例健康體檢者，分析腫瘤抑制因子CYLD 和NF-κB 信號(hào)通路與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系。具體報(bào)告如下：

1 資料及方法

1.1 一般資料

選取2020 年8 月至2022 年8 月廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院收治的58 例潰瘍性結(jié)腸炎患者和同期在該院接受體檢的55 例健康體檢者作為研究對(duì)象。將58 例潰瘍性結(jié)腸炎患者作為觀察組，將55 例健康體檢者作為對(duì)照組。觀察組：年齡23 ～79 歲，平均（45.32±1.02）歲；女性28 例，男性30 例；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.35 ～26.68 kg/m2，平均（23.21±1.02）kg/m2。對(duì)照組：年齡22 ～78 歲，平均（45.31±1.01）歲；女性22 例，男性33 例；BMI 21.45 ～26.78 kg/m2，平均（23.26±1.06）kg/m2。兩組研究對(duì)象的基本資料相比，P＞0.05。本研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。研究對(duì)象的入選標(biāo)準(zhǔn)：1）觀察組患者均滿(mǎn)足《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018 年·北京)》[4]中關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的判定標(biāo)準(zhǔn)；2）有完整的病歷記錄。研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：1）癌變患者，如直腸癌、乳腺癌、肺癌等；2）心腦血管病變者；3）血液疾病患者；4）精神/ 認(rèn)知異常者。

1.2 方法

研究對(duì)象均接受結(jié)腸黏膜組織中CYLD 和NFkB mRNA 指標(biāo)的檢測(cè)。方法是：在腸鏡協(xié)助下，鉗取受檢者的腸黏膜組織作為活檢組織，取出后將其置于TrizoI 原液中，并保存在零下80℃環(huán)境中待測(cè)。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 法〔儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀m2000rt RealTime PCR System，注冊(cè)證號(hào)：國(guó)械注進(jìn)20173401170 ；試劑為儀器配套試劑，購(gòu)自雅培貿(mào)易（上海）有限公司〕檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織中CYLD和NF-kB mRNA 的表達(dá)狀況，操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分析觀察組患者的病歷資料，記錄其性別、年齡、病程、吸煙史、病變部位、病變分期、病變程度等指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)判定

CYLD 檢測(cè)：組織標(biāo)本未顯色為0 分，顯淡黃色為1 分，顯棕黃色為2 分，顯棕褐色為3 分；各標(biāo)本組織觀察視野隨機(jī)選取5 個(gè)，觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞占比，0 分：＜5%，1 分：5% ～25%，2 分：26% ～50%，3 分：51% ～75%，4 分：＞75%。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分× 染色強(qiáng)度評(píng)分=免疫組織化學(xué)評(píng)分，0 分為陰性（-），1 ～2 分為弱陽(yáng)性（+）、3 ～4 分為中度陽(yáng)性（++）、5 ～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。對(duì)比觀察組與對(duì)照組的CYLD 和NF-kB mRNA 指標(biāo)。分析CYLD指標(biāo)異常在潰瘍性結(jié)腸炎臨床表型中的分布狀況。本研究所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)均由2 名專(zhuān)人負(fù)責(zé)，若發(fā)生分歧，根據(jù)所得資料和相應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)等商討確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS 22.0 版本）分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗(yàn)。采用Log-Logistic 參數(shù)回歸分析法分析CYLD 指標(biāo)異常在潰瘍性結(jié)腸炎臨床表型中的分布狀況；若P＜0.05，則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較觀察組與對(duì)照組的CYLD 和NF-kBmRNA指標(biāo)

觀察組CYLD mRNA 的水平低于對(duì)照組，NF-kB mRNA 的水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。經(jīng)Spearman相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，CYLD mRNA 水平與潰瘍性結(jié)腸炎病變之間為負(fù)性關(guān)系（r=-0.2511，P＜0.05），NFkB mRNA 水平與潰瘍性結(jié)腸炎病變之間為正性關(guān)系（r=0.5165，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 比較觀察組與對(duì)照組CYLD 和NF-kB mRNA 的表達(dá)狀況（± s）

表1 比較觀察組與對(duì)照組CYLD 和NF-kB mRNA 的表達(dá)狀況（± s）

組別 例數(shù) CYLD mRNA NF-kB mRNA觀察組 58 0.82±0.11 22.32±1.02對(duì)照組 55 1.76±0.13 10.25±1.06 t 值 49.3712 73.3877 P 值 0.0001 0.0001

2.2 分析CYLD 蛋白陽(yáng)性率在潰瘍性結(jié)腸炎臨床表型中的分布狀況

觀察組中共檢出CYLD 蛋白陽(yáng)性55 例。經(jīng)單因素分析后得知，年齡≥60 歲（100.00%）、病程時(shí)間≥1 年（98.21%）、病變分期為活動(dòng)期（100.00%）、病變程度為重度（100.00%）和中度（100.00%）患者的CYLD 蛋白陽(yáng)性率更高（P＜0.05）。Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，CYLD 蛋白陽(yáng)性率與潰瘍性結(jié)腸炎患者的病程、病變程度、病變分期、年齡呈正性關(guān)系。見(jiàn)表2、表3。

表2 單因素分析CYLD 蛋白陽(yáng)性率在潰瘍性結(jié)腸炎臨床表型中的分布狀況[例(%)]

表3 Logistic 回歸分析CYLD 蛋白陽(yáng)性率與潰瘍性結(jié)腸炎臨床表型的相關(guān)性

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于臨床較為常見(jiàn)的慢性腸道炎性病變[5]，且其具有非特異性特征。目前暫不完全明確其發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為與機(jī)體免疫因素、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)。目前，有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎的治療存在治療藥物價(jià)格高、不良反應(yīng)多等缺陷[6]，患者的治療負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力均較大。因此，進(jìn)一步深入分析潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制具有積極意義。

有報(bào)道稱(chēng)，NF-kB 在機(jī)體炎性反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，若可通過(guò)分析NF-kB 信號(hào)通路而探尋治療潰瘍性結(jié)腸炎的新型藥物，則有可能打破目前存在的治療藥物價(jià)格高、患者醫(yī)療負(fù)擔(dān)重、藥物不良反應(yīng)多的局限性，提升相關(guān)臨床治療療效和患者的生活質(zhì)量[7-8]。目前已證實(shí)核因子Kappa-B 家族在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域有重要且廣泛的參與作用[9]。此家族主要由cRe1、Re1B、Re1A/p65、NF-kB 等組成。其中，NF-kB 信號(hào)持續(xù)活化狀態(tài)不僅會(huì)參與腫瘤發(fā)病，且與機(jī)體的慢性炎性反應(yīng)有關(guān)[10]。非激活狀態(tài)下，NF-kB可結(jié)合抑制蛋白IkB，在胞漿中主要表現(xiàn)為二聚體形式。而對(duì)應(yīng)的IkB 激酶復(fù)合物（IKK）對(duì)復(fù)合物有關(guān)的IkB 磷酸化有誘導(dǎo)作用，可促進(jìn)降解和泛素化IkB。當(dāng)降解IkB 蛋白后，NF-kB 和相應(yīng)結(jié)合則會(huì)消失，并迅速轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中結(jié)合DNA kB 區(qū)域，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄相應(yīng)特定基因[11]。NF-kB 信號(hào)活化中，泛素化也發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，泛素化屬于可逆過(guò)程，并可被DUBs 家族蛋白阻斷，讓NF-kB 通路活化受到抑制。而CYLD 為DUBs 的主要家族成員之一[12]，其屬于目前公認(rèn)的腫瘤抑制因子，可直接結(jié)合NF-kB 的調(diào)節(jié)亞單位、TNFR、TRAF2，進(jìn)而組織NF-kB 活化。本研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)CYLD mRNA 水平比健康者低，NF-kB mRNA 水平比健康者高（P＜0.05），發(fā)現(xiàn)CYLD mRNA 在正常對(duì)照組中呈高表達(dá)狀態(tài)，NF-kB mRNA 在正常對(duì)照組中呈低表達(dá)狀態(tài)，這也證實(shí)了CYLD 蛋白的去泛素化活性可以負(fù)性調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，包括NF-κB 相關(guān)通路。同時(shí)，本研究Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，CYLD 蛋白陽(yáng)性率與潰瘍性結(jié)腸炎患者的年齡、病程、病變程度呈負(fù)性關(guān)系。崔小魯[13]的研究報(bào)告中有提到相似觀點(diǎn)，即NF-kB 信號(hào)持續(xù)活化存在于炎性反應(yīng)和腫瘤病變中。而大部分腫瘤病變的前期均會(huì)經(jīng)歷炎性反應(yīng)，因此其病程越長(zhǎng)、病變?cè)絿?yán)重，CYLD 蛋白陽(yáng)性率也就越高。加之患者年齡越大，機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能逐步退化，身體免疫功能降低，進(jìn)而也為CYLD 降低并參與病變提供了條件。此外，本研究在分析潰瘍性結(jié)腸炎病變分期時(shí)分為活動(dòng)期、緩解期兩種，出現(xiàn)CYLD 蛋白陽(yáng)性率與病變分期之間有正性關(guān)系的原因可能與病變活動(dòng)期各病灶細(xì)胞處于活躍狀況有關(guān)。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生癌變概率較大，其預(yù)后通常不理想，而CYLD 蛋白在結(jié)直腸癌變中有重要參與作用，因此筆者認(rèn)為這就是活動(dòng)期CYLD 蛋白陽(yáng)性率更高的原因之一，其他具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入分析。

綜上，CYLD 受抑制可能活化NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展，且CYLD 的表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎的臨床表型具有相關(guān)性。上述結(jié)論可為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探討提供研究基礎(chǔ)，有利于開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)。CYLD 或能成為新的潛在治療靶點(diǎn)，為治療潰瘍性結(jié)腸炎提供新的治療策略，進(jìn)一步提高潰瘍性結(jié)腸炎臨床診療的水平。