花椒葉黃酮的提取工藝優化及其抗氧化活性檢測

金偉嘉，盧利平，2*，劉曉瑩，李佳怡，楊揚

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.生物醫學研究中心中國馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬蕓香科、花椒屬，是我國特有的具有悠久種植歷史的一種食物香料，尤其在我國北方是著名的香料及油料樹種[1]。花椒除了是我國食品工業中常用的香辛調味料[2]以外，還具有一定的藥用價值[3]。花椒葉作為花椒的典型副產品，它的特點包括麻香味濃厚和營養成分豐富。花椒葉中富含黃酮類化合物、糖苷、多酚、芳香油等多種活性成分[4-5]，其中黃酮類化合物具有抑菌[6]、抗癌[7-8]、抗氧化[9]、降血脂[10]、降血壓、保護心臟、抗衰老、抗炎等藥理活性[11]，已被廣泛應用于食品、化妝品、藥品等領域[12-13]，因而可知，對花椒葉中黃酮類化合物進行開發利用具有較高的研究價值。

花椒栽植被甘肅作為貧困山區精準扶貧富民產業的主要行業來培育，栽植面積逐漸擴大[14]，品質優異，花椒產品遠銷國內外，受到一致好評。但對于花椒資源主要是果實的采收與加工，忽略了對花椒葉中各組成成份的開發與綜合利用，極大地浪費了花椒葉這一低值副產品。花椒葉中富含黃酮類化合物，可作為良好的黃酮提取原材料，其中大紅袍因其色澤鮮艷，麻味更濃，是最具代表性的花椒優良品種。因此，對花椒葉中黃酮類化合物的提取進行優化，并對生物活性進行研究可以提高花椒葉的附加值，延長花椒產品產業鏈，同時增加了山區椒農的經濟收入，也對扶貧工作起到一定的輔助作用。本試驗采用超聲波輔助法探討天水花椒葉中黃酮類化合物的提取工藝，并通過Box-Behnken設計響應面進行優化，以此確定最佳工藝參數，為花椒葉的進一步開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

花椒葉(大紅袍花椒葉，2020年5月采摘自甘肅甘谷縣大象山鎮)；無水乙醇、丙酮、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉(粒)、水楊酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、30%過氧化氫均為分析純(蘭州市奧科生物技術有限公司)；蘆丁標準品(Solarbio公司)；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)(上海麥克林生化科技有限公司)。

AR224CN電子分析天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；TD5Z離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)；SB-500DTY超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WJX-200型高速多功能粉碎機(上海緣沃工貿有限公司)；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DHG-9420A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；L3S可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 花椒葉黃酮提取工藝流程

大紅袍花椒葉干燥→粉碎過篩→脫色處理→超聲提取→離心→黃酮提取液。

1.2.2 原料處理

洗凈新鮮摘取的花椒葉，除去葉柄，自然晾干，在60 ℃烘箱中烘至恒重，即得干燥的花椒葉。粉碎花椒葉并過80目篩(孔徑0.177 mm)，丙酮浸泡過夜后，進行抽濾，將抽濾過后的花椒葉粉放置30 ℃烘箱中烘干至恒重，完成脫色處理，將處理好的花椒葉粉放入封口袋，密封保存備用。

1.2.3 提取

向比色管中加入準確稱量好的1 g花椒葉粉，在超聲頻率40 kHz下，在一定體積分數的乙醇溶液、液料比、浸提時間、浸提溫度下進行超聲波輔助處理。過濾收集，在提取2次后合并上清液，于12 000 r·min-1離心15 min，最終提取液為定容至50 mL的上清液。

1.2.4 蘆丁標準曲線的繪制

稱量適量的蘆丁標準品，用30%乙醇溶液配制得到0.2 mg·mL-1的蘆丁標準品儲備液。通過吸取不同體積(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL)的蘆丁標準品準備液置于10 mL具塞試管中來設置不同濃度梯度，加入80%乙醇溶液補到5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，反應6 min，再加入4% NaOH溶液4 mL，混合均勻后用蒸餾水定容至刻度線，15 min后于510 nm波長處測定其吸光值[15]。

1.2.5 黃酮含量的測定

準確移取0.5 mL花椒葉提取液放到10 mL具塞試管中，以80%乙醇溶液定容到5 mL，混合均勻后同1.2.4節操作方法進行反應，于波長510 nm處測量其吸光值，花椒葉中黃酮濃度依據標準曲線推算，并計算黃酮的得率[16]。

1.3 單因素試驗設計

1.3.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，浸提溫度為50 ℃、浸提時間為50 min，研究乙醇體積分數分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%時對花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.2 浸提時間對黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，乙醇體積分數為60%，浸提溫度為50 ℃，研究浸提時間分別為25、30、35、40、45、50 min時對花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.3 浸提溫度對黃酮得率的影響

控制液料比為30∶1 mL·g-1，乙醇體積分數為60%，浸提時間為40 min，研究浸提溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃時對花椒葉黃酮得率的影響。

1.3.4 液料比對黃酮得率的影響

控制乙醇體積分數為60%，浸提溫度為55 ℃，浸提時間為40 min，研究液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL·g-1時對花椒葉黃酮得率的影響。

1.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，按照Box-Behnken設計原理工藝優化選取乙醇濃度(A)、浸提時間(B)、浸提溫度(C)、液料比(D)4個因素作為自變量，以花椒葉黃酮得率為響應值，依據試驗因素和水平設計進行響應面試驗設計，優化黃酮的提取工藝。

-1、0、1水平：A分別為55%、60%和65%；B分別為35、40和45 min；C分別為50、55和60 ℃；D分別為30∶1、35∶1和40∶1 mL·g-1。

1.5 大紅袍花椒葉黃酮抗氧化能力的測定

許多研究發現自由基與人體的健康息息相關，自由基含量超過一定標準，會干擾人體正常的新陳代謝活動，甚至會誘發心血管疾病、癌癥等[17-18]，因此，測定其抗氧化能力是具有一定意義的。

1.5.1 DPPH清除能力的測定

參照宋巖等[19]的方法測定。采用最優工藝參數提取大紅袍花椒葉樣品中的黃酮，稀釋提取液得到質量濃度為30、60、90、120、150 μg·mL-1的黃酮提取液，各取1.0 mL于10 mL具塞試管中，再分別加入精確吸取2 mL的0.2 mol·L-1DPPH溶液，充分混勻后，室溫靜置避光30 min，測定于517 nm處的吸光值；用無水乙醇替代樣品溶液測得吸光值，用無水乙醇替代DPPH溶液測得吸光值，配制同濃度VC溶液作為陽性對比，計算自由基清除率。

1.5.2 OH自由基清除能力的測定

測定方法采用水楊酸比色法[20]進行測定，配制相同濃度的VC溶液作為陽性對比，計算羥基自由基的清除率。

1.6 數據處理

最終結果取3次平行試驗的平均值，利用Office Excel數據分析軟件、Origin 8.0制圖軟件和Design-Expert 8.06響應面設計軟件進行結果分析。

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示，以蘆丁標準品濃度為橫坐標，517 nm處吸光值為縱坐標進行繪制。得到標準曲線方程為：y=8.687 1x+0.002 6，相關系數R2=0.999 3，且在0.01～0.05 mg·mL-1呈現良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準品濃度與吸光值的標準曲線

2.2 單因素影響

2.2.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

由圖2可得，隨著乙醇體積分數的增大，黃酮得率先逐漸上升，當乙醇體積分數為60%時，黃酮得率達到最高；繼續提高乙醇體積分數，黃酮得率下降趨勢明顯。依據相似相溶規律可知，黃酮溶于乙醇的量與兩者極性密切相關，花椒葉中黃酮的極性與60%的乙醇溶液相近，故得率為最大值。隨著乙醇體積分數繼續增大，觀察到提取液的顏色開始向綠色轉變，這可能是由于醇溶性雜質、色素等其他成分溶出量的增加，這些會同黃酮類化合物形成競爭關系，導致黃酮得率下降[21]。根據花椒葉黃酮得率變化規律，選取55%～65%的乙醇體積分數進行響應面優化試驗設計。

圖2 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

2.2.2 浸提時間對黃酮得率的影響

由圖3可得，在一定時間范圍內，大紅袍花椒葉黃酮得率呈現先增加后減少的變化規律，在浸提時間為40 min時，黃酮得率最高為13.85%；浸提時間超過40 min后，黃酮得率不增反而有緩慢下降趨勢。原因可能為隨著時間的增加，黃酮提取會越來越充分，但時間過長會使得黃酮部分結構破壞，導致得率降低[22]。根據花椒葉黃酮得率變化規律，浸提時間選取35～45 min進行響應面優化試驗設計。

圖3 浸提時間對黃酮得率的影響

2.2.3 浸提溫度對黃酮得率的影響

由圖4可得，在浸提溫度40～55 ℃黃酮得率，隨著浸提溫度的上升而增大，當溫度超過55 ℃后，黃酮得率開始下降。這是因為在一定的溫度范圍能夠促進黃酮分子的運動速率，從而提高黃酮的溶出，但是超過一定溫度界限，黃酮中熱穩定性較低的結構被破壞，其他雜質的析出比例上升，因而黃酮的得率會有所降低[23]。根據花椒葉黃酮得率變化規律，浸提溫度選取50～60 ℃進行響應面優化試驗設計。

圖4 浸提溫度對黃酮得率的影響

2.2.4 液料比對黃酮得率的影響

由圖5可得，在液料比為20∶1～35∶1 mL·g-1，黃酮得率隨著液料比的升高而升高，當液料比超過35∶1 mL·g-1后，黃酮得率呈下降趨勢。這是由于當浸提液含量占比較小時，花椒葉中黃酮不能完全溶出；隨著溶劑量增加，雜質溶出量增加導致黃酮提出率降低，過量的乙醇導致黃酮損失[24]。根據花椒葉黃酮得率變化規律，液料比選取30∶1～40∶1 mL·g-1進行響應面優化試驗設計。

圖5 液料比對黃酮得率的影響

2.3 響應面設計

2.3.1 響應面法試驗設計結果

基于單因素試驗結果，通過Design-Expert 8.06軟件設計，以A、B、C、D為自變量，以花椒葉黃酮得率為響應值進行響應面分析，響應面試驗設計方案及結果如表1所示，其中25、26、27、28、29是中心試驗，其余為析因試驗。得到黃酮提取液的擬合回歸方程為：Y=15.25-0.11A+0.030B+0.32C-1.12D+0.038AB+0.084AC-0.17AD+0.24BC-0.18BD+0.16CD-2.01A2-2.19B2-2.33C2-1.60D2。

表1 響應面設計方案及黃酮得率

2.3.2 響應面法試驗設計分析

RSM圖形可以直觀評估乙醇體積分數、浸提溫度、浸提時間和液料比對黃酮得率的影響，如圖6～11所示。交互效應的強弱趨向可以被響應面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映，交互效應強弱水平可以從投影面的等高線形狀中觀察，曲面傾斜度越大，則該因素對響應值的影響越顯著[25]。對比圖6～11，液料比對黃酮得率的影響最大，其次是浸提溫度和浸提時間，乙醇體積分數影響較小。各因素等高線橢圓形狀不明顯，表明其交互作用不顯著，符合回歸方程的方差分析結果[26]。

圖6 乙醇體積分數與浸提時間對黃酮得率的影響

圖7 乙醇體積分數與浸提溫度對黃酮得率的影響

圖8 乙醇體積分數與液料比對黃酮得率的影響

圖9 浸提溫度與浸提時間對黃酮得率的影響

圖10 浸提時間與液料比對黃酮得率的影響

圖11 浸提溫度與液料比對黃酮得率的影響

2.3.3 驗證試驗

通過Design-Expert 8.06軟件設計分析結果，得到黃酮得率取得最大值時的工藝條件為：乙醇體積分數59.94%，浸提時間40.12 min，浸提溫度55.29 ℃，液料比33.26 mL·g-1，在此條件下，黃酮得率為15.45%。考慮實際情況，適當調整工藝條件，即乙醇體積分數60%，浸提時間40 min，浸提溫度55 ℃，液料比33∶1 mL·g-1。為進一步驗證該工藝的準確性，在此條件下進行3組驗證試驗，測得的實際黃酮得率平均值為15.40%(表2)，接近理論預測值(相對誤差為0.32%)，說明響應面法優化花椒葉黃酮的提取工藝條件具有可行性。

表2 驗證試驗的黃酮得率

2.4 大紅袍花椒葉黃酮提取液的抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除率

由圖12可得，質量濃度在30～150 μg·mL-1內隨樣品濃度的增加，清除率逐漸增加，在濃度范圍內，黃酮提取液對DPPH的清除效果略高于VC溶液，當濃度在150 μg·mL-1時，VC的清除能力開始超過黃酮提取液。綜合來看，表明大紅袍花椒葉黃酮具有較好的DPPH清除能力。

圖12 大紅袍花椒葉黃酮對DPPH自由基的清除能力

2.4.2 OH自由基清除率

由圖13可得，黃酮提取液與VC溶液對OH自由基的清除能力隨著樣品濃度的升高逐漸增強，在濃度范圍內，黃酮提取液對OH自由基的清除能力相較于VC溶液更優，當樣品質量濃度為150 μg·mL-1時，對OH自由基的清除率達到72.50%，表明花椒葉黃酮的抗氧化性良好。

圖13 大紅袍花椒葉黃酮對OH自由基的清除能力

3 小結

采用響應面法優化了超聲輔助提取大紅袍花椒葉黃酮的工藝，建立了乙醇體積分數、浸提溫度、浸提時間和液料比對大紅袍花椒葉黃酮浸提量影響的回歸模型。結果表明，各因素對黃酮得率的影響次序為液料比>浸提溫度>浸提時間>乙醇體積分數，由此得到最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數60%，浸提時間40 min，浸提溫度55 ℃，液料比33∶1 mL·g-1，在該條件下，大紅袍花椒葉中黃酮得率達到(15.40±0.05)%。從抗氧化活性試驗得出大紅袍花椒葉黃酮對DPPH和OH自由基的清除效果良好，可作為提取天然抗氧化劑的原料，提高花椒葉的附加價值，為花椒副產物的開發利用提供理論參考。