浙江省羊肉樣品中10種喹諾酮類藥物殘留檢測及風(fēng)險(xiǎn)評估

王小驪，楊華，汪建妹，童喻浩，廖琳慧，肖英平，吉小鳳*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2.湖州市梅溪鎮(zhèn)人民政府便民服務(wù)中心，浙江 湖州 313307；3.麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 麗水 323000)

隨著居民生活水平的提高，對于肉食品的種類及產(chǎn)量的需求逐漸增長，特別是羊肉呈供應(yīng)緊張的態(tài)勢。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國羊肉產(chǎn)量為441萬t[1]。《全國草食畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016—2020年)》中提出，“十三五”時(shí)期草食畜牧業(yè)發(fā)展目標(biāo)是在2020年羊肉產(chǎn)量達(dá)500萬t[1]。肉羊產(chǎn)業(yè)已成為改善居民膳食結(jié)構(gòu)的重要產(chǎn)業(yè)。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和壯大，越來越多的獸藥應(yīng)用于生產(chǎn)中，其使用時(shí)間幾乎貫穿動(dòng)物飼養(yǎng)的全過程。近年來動(dòng)物濫用抗生素的危害，正在迅速向人類傳導(dǎo)，動(dòng)物性食品的食用安全已成為人們關(guān)注的健康問題。

喹諾酮類藥物是一類廣譜抗菌藥物，在臨床應(yīng)用中具有良好的抑菌及殺菌作用。常見的喹諾酮類藥物有環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星等，具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、組織穿透力強(qiáng)、給藥方便、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。該類藥物在獸醫(yī)臨床感染性疾病的治療和預(yù)防上應(yīng)用越來越廣泛[2]，但由于藥物濫用，導(dǎo)致其在動(dòng)物上出現(xiàn)毒性反應(yīng)，并存在殘留危害，使致病菌產(chǎn)生耐藥性，而且對人體也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)[3]。

近年來，全國各地監(jiān)測中，羊肉樣品不斷有喹諾酮類藥物殘留檢出。參照GB 31650—2019[4]規(guī)定，羊肉中恩諾沙星殘留限量標(biāo)準(zhǔn)值為≤100 μg·kg-1。2020年9月，山東龍口市一家餐飲管理有限公司銷售的生羊肉中恩諾沙星檢出值為748 μg·kg-1，超標(biāo)7倍多[5]；2016年1月，國家食藥監(jiān)總局公布新一期的食品抽檢信息，其中3批次由寧夏中瑩牧業(yè)有限公司生產(chǎn)的羊后腿肉檢出值為5 782 μg·kg-1，恩諾沙星超標(biāo)57倍[6]。2020年10月，上海市一家鮮肉經(jīng)營部羊腿中恩諾沙星檢出值為1 520 μg·kg-1，超標(biāo)15倍，其羊排中的檢出值為30 800 μg·kg-1，超標(biāo)308倍[7]。上述產(chǎn)品均不符合國家食品安全規(guī)定。據(jù)報(bào)道，恩諾沙星雖不具有致癌性及畸胎反應(yīng)，急性毒性低，但大劑量恩諾沙星對人及動(dòng)物都具有一定的毒性，其副作用包括腸道障礙、高致敏感性反應(yīng)及結(jié)晶尿[8]。由于恩諾沙星屬于人畜供用藥，人群若長期攝入含有微量恩諾沙星藥物殘留的動(dòng)物源性食品，有可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[9]。

浙江省有充足的草地面積和經(jīng)濟(jì)作物副產(chǎn)物，適于飼養(yǎng)羊等草食動(dòng)物。羊養(yǎng)殖過程中，因飼養(yǎng)者對獸藥使用方法和性能缺乏了解，對獸藥殘留危害認(rèn)識不足，可能存在飼養(yǎng)單位未按農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定要求執(zhí)行動(dòng)物屠宰休藥期規(guī)定，或發(fā)病食品動(dòng)物大劑量、長時(shí)間使用抗生素，導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留過多，影響到動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)。目前網(wǎng)絡(luò)報(bào)道羊肉樣品中喹諾酮類藥物檢出情況較多，但有關(guān)羊肉中藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估的研究并不多[10]。本研究利用浙江省內(nèi)生產(chǎn)環(huán)節(jié)和流動(dòng)環(huán)節(jié)隨機(jī)采集的120批次羊肉樣品作為樣本，結(jié)合我國居民不同性別和年齡組肉類消費(fèi)量及平均體重，分析羊肉樣品中喹諾酮類藥物殘留水平，評估膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)水平，為引導(dǎo)消費(fèi)和科學(xué)監(jiān)管提供相關(guān)參考數(shù)據(jù)和信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用隨機(jī)抽樣方法，在浙江省內(nèi)各地市的屠宰場、養(yǎng)殖場、農(nóng)貿(mào)市場、批發(fā)市場、超市共采集羊肉樣品120批次。樣品的采集按照農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品抽樣標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行，所采集羊肉樣品均為羊腿肌肉部位，絞碎均質(zhì)后，置于-20 ℃冷凍待測。標(biāo)準(zhǔn)品恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、佛洛沙星、司氟沙星、達(dá)氟沙星的純度均大于98.0%(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈色譜純(德國默克公司)；甲酸銨分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；甲酸和乙酸(純度99.0%，美國ACS恩科化學(xué))；所用水為超純；OasisPRiME HLB固相萃取小柱(6 mL，200 mg)，美國Waters 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SciexQTRAP 6500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS，美國AB SCIEX公司)；T25勻漿機(jī)(德國IKA公司)；EOFO-945616(渦旋儀，美國Talboys公司)；BiofugePrimoR離心機(jī)(德國ThermoFisher公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸)，渦旋1 min，超聲20 min，8 500 r·min-1離心3 min，取上清液2.5 mL，加入固相小柱內(nèi)(OasisPRiME HLB)，無需活化，收集流出液，渦旋30 s，取1 mL過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18保護(hù)柱(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)和色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，樣品溫度25 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.3 mL·min-1，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液+2 mmol·L-1甲酸銨水溶液(A)和甲醇(B)。

梯度洗脫程序。0～1.0 min，95% B；1.0～3.0 min，95%～80% B；3.0～7.5 min，80%～5% B；7.5～10.0 min，5% B；10.0～10.1 min，5%～95% B；10.1～12.0 min，95% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，多反應(yīng)檢測(MRM)模式，氣簾氣和碰撞氣均為氮?dú)猓x子噴霧電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，霧化溫度300 ℃。以一級全掃描質(zhì)譜圖中的喹諾酮類藥物準(zhǔn)分子離子作為各自的母離子，對其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，以峰度較強(qiáng)的二級碎片離子作為各自的定量離子，以上述離子反應(yīng)進(jìn)行定量分析，具有較高的專屬性。

1.4 風(fēng)險(xiǎn)評估方法

本研究根據(jù)國際食品法典委員會(huì)制定的食品中污染物危害性點(diǎn)評估的概念與步驟，用風(fēng)險(xiǎn)商(HQ)評價(jià)羊肉產(chǎn)品的安全狀態(tài)[12]。

(1)

式中：EDI為每日攝入量的估計(jì)值[μg·(kg·d)-1]；C為食物中的平均殘留值(μg·kg-1)；F為食物的消費(fèi)量(以肉類消費(fèi)量計(jì)算，kg·d-1)；bw為體重(kg)。

(2)

式中：ADI為每日允許攝入量[μg·(kg·d)-1]；HQ<1表示風(fēng)險(xiǎn)可接受，值越小則風(fēng)險(xiǎn)越小；HQ>1表示有不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，值越大則風(fēng)險(xiǎn)越大。

風(fēng)險(xiǎn)評估中肉類消費(fèi)數(shù)據(jù)和不同人群的平均體重?cái)?shù)據(jù)來源于第四次中國總膳食研究[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”標(biāo)識。食品中低水平污染物可信評價(jià)中對未檢出數(shù)據(jù)處理原則：未檢出數(shù)據(jù)的比例高于60%時(shí)，所有未檢出數(shù)據(jù)用檢出限(LOD)替代；未檢出數(shù)據(jù)比例不大于60%時(shí)，所有未檢出數(shù)據(jù)用1/2 LOD替代[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)多反應(yīng)監(jiān)測模式實(shí)現(xiàn)對10種喹諾酮類藥物同時(shí)檢測，檢測參數(shù)質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 10種喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)

本研究建立固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定羊肉樣品中10種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，并對該方法的線性、靈敏度、回收率及基質(zhì)效應(yīng)等進(jìn)行驗(yàn)證。表2顯示，10種喹諾酮類藥物在2.0～100 μg·L-1呈線性，R2均大于0.99；不同濃度加標(biāo)回收試驗(yàn)所得回收率為70.4%～83.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<9.4%。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有強(qiáng)大的定性和定量檢測能力，但質(zhì)譜分析過程可能會(huì)發(fā)生離子抑制或離子增強(qiáng)現(xiàn)象，從而影響所分析化合物的準(zhǔn)確定量，因此，基質(zhì)效應(yīng)已成為影響高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法準(zhǔn)確定量的因素之一。本研究中，基質(zhì)效應(yīng)為0.4～0.6，表明基質(zhì)效應(yīng)影響可以接受。10種喹諾酮類藥物在該方法中最低檢出限(3×信噪比)和定量限(10×信噪比)分別為1.0和3.0 μg·kg-1。方法驗(yàn)證結(jié)果表明，方法具有良好的準(zhǔn)確性和特異性，準(zhǔn)確可靠。

表2 羊肉樣品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2 羊肉中喹諾酮類藥物殘留分析

采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對浙江省采集的120批次羊肉樣品進(jìn)行10種喹諾酮類藥物篩查。表3顯示，120批次羊肉樣品中共檢出4批次，檢出率為3.3%，均未超過國家規(guī)定的羊肉中恩諾沙星殘留最高限量值，樣品合格率為100%。對羊肉樣品中10種喹諾酮類藥物殘留篩查分析顯示，只有恩諾沙星殘留檢出，其他9種均未檢出，恩諾沙星殘留濃度為3.4～4.3 μg·kg-1。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，恩諾沙星可用于牛、羊、豬、兔、禽等食用畜禽及其他動(dòng)物，在牛、禽和其他動(dòng)物的肌肉中的最高殘留限量值為100 μg·kg-1。

表3 羊肉中喹諾酮類藥物殘留檢出結(jié)果

2.3 羊肉中喹諾酮類藥物膳食暴露評估分析

本研究以《第四次中國總膳食研究》中10個(gè)性別年齡組肉類消費(fèi)量及平均體重為參考值，評估羊肉樣品中恩諾沙星藥物慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。膳食評估方法中，點(diǎn)評估為最常用且最便捷的暴露評估方法[12]。結(jié)合我國不同人群膳食攝入數(shù)據(jù)、平均體重和羊肉樣品中恩諾沙星殘留平均濃度(0.79 μg·kg-1)，計(jì)算得出人群每日攝入量估計(jì)值。恩諾沙星每日允許攝入量為6.2 μg·(kg·d)-1。表4評估顯示，EDIs和HQ的范圍遠(yuǎn)<1，表明浙江省內(nèi)抽取的羊肉樣品中恩諾沙星殘留的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)處于可控水平，未對人體健康構(gòu)成危害。

表4 羊肉樣品中恩諾沙星藥物殘留慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估

3 小結(jié)與討論

本研究利用改進(jìn)的固相萃取前處理方法，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析羊肉中10種喹諾酮類藥物殘留，試驗(yàn)結(jié)果表明，羊肉樣品中恩諾沙星藥物殘留有檢出，但未超過國家的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019)，其他喹諾酮類藥物如沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星均未檢出。目前研究中，禽產(chǎn)品和水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢出較多[15-16]，而牛羊肉產(chǎn)品中喹諾酮類藥物分析的較少。劉鋼等[17]分析了石河子屠宰牛羊組織中獸藥殘留，抽查的30批次羊肝中均未檢出喹諾酮類藥物殘留；向俊等[18]分析了湖南省各地區(qū)畜禽肉中磺胺類藥物殘留情況，共抽檢羊肉樣品40批次，其中3批次檢出磺胺類藥物，檢出率為7.5%；張巍等[17]共采集100批次樣品，篩查的環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星等藥物，均未檢出；貝亦江[18]報(bào)道水產(chǎn)品中嗯諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星等6種喹諾酮類藥物殘留檢出率為0～24.2%，殘留量范圍為0～964.0 μg·kg-1。

食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估分析就是對食品中有害人體健康的因素進(jìn)行評估。根據(jù)評估的風(fēng)險(xiǎn)程度確定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)管理措施來降低或控制影響食品安全的風(fēng)險(xiǎn)因素[19]。通過對羊肉樣品中檢出頻率高的恩諾沙星藥物開展膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估表明，人體通過攝入含有恩諾沙星藥物殘留的羊肉，膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商遠(yuǎn)<1，其安全狀態(tài)在可接受范圍內(nèi)。膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)論為浙江省內(nèi)羊肉中喹諾酮類藥物殘留不會(huì)對人體造成危害效應(yīng)，安全狀態(tài)可以接受，可以放心使用。從試驗(yàn)結(jié)果來看，相關(guān)部門不必進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理程序。前期研究中，王淑等[20]報(bào)道，通過2019—2020年采樣檢測分析羊肉中特布他林等9種主要β-受體激動(dòng)劑，表明連續(xù)2 a抽取的140批次羊肉中，9種β-受體激動(dòng)劑均未檢出，羊肉產(chǎn)品中不存在9種β-受體激動(dòng)劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)隱患，對食品安全沒有影響。

本研究中計(jì)算恩諾沙星藥物殘留暴露水平時(shí)存在一些不確定因素。一是計(jì)算暴露水平時(shí)，膳食攝入數(shù)據(jù)為肉類，而本研究中只計(jì)算了羊肉攝入過程中恩諾沙星殘留的安全水平，并未對其他肉類品種中恩諾沙星殘留和攝入情況進(jìn)行評估；二是研究中采用的膳食數(shù)據(jù)來源于2007年中國總膳食研究，距離目前年份較遠(yuǎn)，中國居民的肉類膳食攝入量可能發(fā)生了變化；三是我國未對恩諾沙星的ADI值進(jìn)行規(guī)定，其參考值為國際參考值。