血清miR-429作為胰腺癌潛在診斷生物標(biāo)志物的價(jià)值研究

黃文濤 邱福南

胰腺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，胰腺癌的中位生存期是3～6 個(gè)月，其5年生存率小于5%[1，2]。盡管手術(shù)技術(shù)和藥物治療有所改進(jìn)，但臨床效果仍不顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)胰腺癌發(fā)病率和死亡率分別為4.2%和4.0%。研究表明，胰腺癌患者從癌癥起始細(xì)胞到轉(zhuǎn)移性癌癥亞克隆平均需要17年左右，且在約2.7年后死亡[3，4]。胰腺癌的早期診治有助于延長(zhǎng)患者的預(yù)后生存時(shí)間[5，6]。因此，篩選、鑒定胰腺癌診斷的分子標(biāo)志物對(duì)于提高胰腺癌患者的生存率具有重要作用。

miR-429 是miR-200 家族成員，在各種腫瘤中差異表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。腎癌患者的miR-429 表達(dá)水平顯著升高，并且過(guò)表達(dá)miR-429可以顯著增加腎癌細(xì)胞增殖并顯著降低細(xì)胞凋亡率[7]。另外有研究將miR-429 鑒定為卵巢癌的驅(qū)動(dòng)因子，綜合生物信息分析和血清表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均顯示miR-429 在卵巢癌中過(guò)度表達(dá)[8]。然而，有些研究結(jié)果表明miR-429 在一些腫瘤中表達(dá)下調(diào)并充當(dāng)腫瘤抑制因子，如miR-429 通過(guò)靶向調(diào)控胃癌中的Myc（V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog) 及FSCN1 （Fascin actin-bundling protein 1）、口腔鱗狀細(xì)胞癌中的ZEB1 （Zinc finger E-box binding homeo-box 1）及肝細(xì)胞癌中的CRKL （V-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like）、TLN1（Talin 1）發(fā)揮抑癌作用[9]。然而miR-429 在胰腺癌中的研究鮮有報(bào)道，本研究主要分析miR-429 在胰腺癌患者中的表達(dá)及其是否可以充當(dāng)胰腺癌診斷的血清檢測(cè)分子標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)其在胰腺癌中的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫(kù)胰腺癌miRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)的提取從癌癥基因圖譜（TCGA）及基因表達(dá)譜（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)GSE71533、GSE24279 及GSE41369 提取miR-429 的表達(dá)及臨床信息。TCGA 數(shù)據(jù)下載自http://www.cbioportal.org/data_sets.jsp，GEO 數(shù)據(jù)下載自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。

1.2 臨床樣本采集采集2015年6月1日～2018年5月30日在我院治療的、經(jīng)病理證實(shí)的50 例胰腺癌患者的癌組織及癌旁組織，以及30 例胰腺癌患者血清樣本及30 例健康者血清樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①18～80 歲；②ECOG-PS 為0～1 分；③手術(shù)切除為主要治療方法；④經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為胰腺癌。在手術(shù)期間收集非腫瘤和腫瘤標(biāo)本，相鄰非腫瘤與癌組織邊界之間的距離約為1cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)患有其他惡性腫瘤者；②嚴(yán)重的、無(wú)法控制的醫(yī)療狀況者；③患有嚴(yán)重精神疾病者。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言的規(guī)則。患者在研究開始前均簽署了書面知情同意書。

1.3 miRNA 提取及熒光定量PCR本研究使用RNAiso for Small RNA 試劑盒（Takara，日本）提取組織和細(xì)胞的miRNAs。miRNAs 通過(guò)Mir-X?miRNA 第一鏈合成試劑盒（Takara，日本）轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Master Mix 試劑盒（Applied Biosystems，美國(guó)）檢測(cè)miR-429 的表達(dá)。RT-qPCR的擴(kuò)增條件為：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 60s，55℃ 1min，95℃ 30s。Mir-X?miRNA第一鏈合成試劑盒中包含miRNA反義引物。U6 用作對(duì)照。引物序列如下所示：miR-429 Sense primer TAATACTGTCTGGTAAAACCGT，U6 Sense primer CTCGCTTCGGCAGCACA。

1.4 分析采用的網(wǎng)站及R 包使用pheatmap 包繪制表達(dá)相關(guān)系數(shù)熱圖，使用Targetscan 網(wǎng)站（http://www.targetscan.org/）分析miR-429 的靶基因。韋恩圖的繪制采用 jvenn 網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），利 用DAVID 網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行KEGG-pathway 及GO-BP 分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，miR-429 在50 對(duì)胰腺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織的差異分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)，miR-429 在胰腺癌患者血清及健康者血清中的差異分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。生存分析采用log-rank test 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-429 在胰腺癌患者組織中的表達(dá)情況GSE71533 數(shù)據(jù)集分析顯示miR-429 在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0.001），見圖1。TCGA 數(shù)據(jù)集分析顯示miR-429 高表達(dá)的胰腺癌患者總生存時(shí)間顯著優(yōu)于miR-429 低表達(dá)的患者[P=0.04，HR=0.65，95%CI（0.43,0.98）]，見圖2。

圖1 miR-429 在GSE71533 數(shù)據(jù)集胰腺癌中的表達(dá)

圖2 miR-429 在TCGA 胰腺癌數(shù)據(jù)集中的預(yù)后分析

miR-429 在50 例胰腺癌患者癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0.01），見圖3A。高表達(dá)患者的miR-429 總生存時(shí)間顯著優(yōu)于低表達(dá)患者[P=0.02，HR=0.44，95%CI（0.21,0.89）]，見圖3B。

圖3 miR-429 在50 對(duì)胰腺癌與癌旁組織中的表達(dá)及預(yù)后分析

2.2 miR-429 在胰腺癌患者血清中的表達(dá)通過(guò)GSE24279 數(shù)據(jù)集檢測(cè)136 例胰腺癌患者及22 例健康者血清中miR-429 的表達(dá)，結(jié)果顯示與健康者相比，胰腺癌患者血清中miR-429 的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），AUC 為0.683，見圖4。

圖4 miR-429 在GSE24279 數(shù)據(jù)集中胰腺癌患者血清中的表達(dá)

通過(guò)檢測(cè)30 例胰腺癌患者和30 例健康者血清中miR-429 的表達(dá)，結(jié)果顯示胰腺癌患者血清中miR-429 的表達(dá)相較于健康者顯著下調(diào)（P＜0.01），AUC 為0.833，說(shuō)明miR-429 是胰腺癌的有效診斷指標(biāo)，見圖5。

圖5 miR-429 在胰腺癌患者血清中的表達(dá)

2.3 miR-429 在胰腺癌中的潛在靶基因及下游信號(hào)通路分析為了進(jìn)一步分析miR-429 在胰腺癌的作用機(jī)制，我們分析了GSE41369 數(shù)據(jù)集中配對(duì)的胰腺癌組織中與miR-429 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的基因，結(jié)果顯示與miR-429 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的基因有699 個(gè)（r＜-0.5）。通過(guò)Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了miR-429 潛在的靶基因，結(jié)果顯示miR-429 潛在的靶基因有1 190 個(gè)。韋恩圖顯示兩者之間交集有156 個(gè)基因。對(duì)這些基因進(jìn)行KEGG-pathway 及GO 分析，KEGG-pathway分析結(jié)果顯示這些差異基因富集在磷脂酶D 信號(hào)通路、感染人類T 細(xì)胞白血病病毒1、系統(tǒng)磷脂酰肌醇信號(hào)等通路；GO-BP 分析結(jié)果顯示這些差異基因富集在細(xì)胞過(guò)程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝過(guò)程負(fù)調(diào)控等信號(hào)通路，見圖6。

圖6 胰腺癌中miR-429 潛在靶基因及下游信號(hào)通路分析

3 討論

胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，研究胰腺癌中差異表達(dá)的分子即可為胰腺癌的治療提供分子靶點(diǎn)。miRNAs 廣泛存在于真核細(xì)胞中，miRNAs 主要通過(guò)靶向靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。

miR-200 家族成員miR-429 的失調(diào)參與了各種癌癥的進(jìn)展。miR-429 在腎母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、骨肉瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胃癌中表達(dá)水平降低。在腎透明細(xì)胞癌中，miR-429 通過(guò)靶向VEGF 抑制細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[10]；在甲狀腺癌中，miR-429 在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。在甲狀腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-429 可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和入侵。此外，ZEB1被鑒定為 miR-429 的靶基因[11]；在骨肉瘤中，miR-429 在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，miR-429 通過(guò)調(diào)控HOXA9 表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲[12]；在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，miR-429通過(guò)調(diào)控SOX2 表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖及侵襲[13]。另一方面，miR-429 在結(jié)直腸癌和前列腺癌中的表達(dá)增加。在結(jié)直腸癌中，miR-429 通過(guò)直接調(diào)控LATS2 表達(dá)并促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖及侵襲[14]；在前列腺癌中，miR-429 通過(guò)調(diào)控p27Kip1 表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，胰腺癌組織中miR-429 的表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)，與健康者相比，胰腺癌患者血清中miR-429 水平降低，表明 miR-429 可能作為胰腺癌的血清診斷標(biāo)志物。通過(guò)表達(dá)相關(guān)性及靶基因預(yù)測(cè)分析，我們發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中miR-429 的表達(dá)可能調(diào)控多個(gè)靶基因，這些靶基因富集在磷脂酶D 信號(hào)通路、感染人類T細(xì)胞白血病病毒1、系統(tǒng)磷脂酰肌醇信號(hào)通路、細(xì)胞過(guò)程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞代謝過(guò)程負(fù)調(diào)控等信號(hào)通路。

綜上，miR-429 在胰腺癌患者組織和血清中的表達(dá)均顯著降低，miR-429 高表達(dá)是胰腺癌患者的有利預(yù)后因素，miR-429 是胰腺癌血清診斷的有效指標(biāo)。miR-429 可能成為胰腺癌診斷及治療的新分子靶點(diǎn)，但其具體的作用機(jī)制仍有待深入探究。