四種精液處理方法在冷凍精子優選中的應用價值對比

李洪成

冷凍精子為男性計劃生育的重要手段,通過停止精子代謝活動,以預防未來生育風險,可作為不孕不育輔助生育手段［1］。冷凍精子優選指通過一系列措施提升精子質量、提升成功孕育能力的重要措施。目前常見優選方式包括MACS、DGC、SU、SW 等,通過不同方式優化出最適宜精子樣本,但目前關于何種優化方式更有利于保證精子正常形態、DNA 完整性研究較少。為此,本次研究選取遼寧省婦幼保健院2020年1～6月期間門診41例志愿者的精液樣本為研究對象,探究以上四種優選方式的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選取遼寧省婦幼保健院2020年1～6月期間門診41例志愿者的精液樣本為研究對象,志愿者的年齡26～37 歲,平均年齡(31.13±2.36)歲。精液樣本納入標準：精液液化時間正常,精液質量符合正常精液標準［2］。

1.2 實驗儀器與試劑 ①miniMACS startingkit：購自德國美天旎生物技術有限公司；②Dead Cell Removal Kit：購自德國美天旎生物技術有限公司；③精子洗滌液：購自秒泉儀器有限公司；④PureCeption 24 測定雙層試劑盒：購自秒泉儀器有限公司；⑤精子活體染色試劑盒：購自博瑞德生物科技有限公司,染色方法為伊紅-苯胺黑染色法；⑥精子DNA 碎片測試試劑盒：購自博瑞德生物科技有限公司；⑦生物顯微鏡：購自日本,奧斯巴林CX41。

1.3 方法 將41例志愿者的精液樣本等分為4 份,制備冷凍精液后,分別應用MACS、DGC、SU、SW 法處理,分別設為A 組、B 組、C 組、D 組。①MACS：1 ml 解凍精液+80 μl 1×結合緩沖液+20 μl MACS AnnexinV 磁珠,混勻,室溫孵育15 min 后,加2 ml 精子洗滌劑,300 g 離心15 min,棄上清后加0.5 ml 1×結合緩沖液重懸,磁場分選柱干預后,以0.5 ml 1×結合緩沖液沖洗分選柱,重復3 次沖洗收集AnnexinV 陰性因子,300 g 離心15 min,棄上清,加0.5 ml 精子洗滌劑重懸,37℃保存；②DGC：以PureCeption 24 測定雙層試劑盒制備密度梯度,形成下層1 ml 80% Isolate,上層1 ml 40% Isolate；取1 ml 解凍精液緩慢加入上層密度,300 g 離心20 min,保留下層,加入2 ml 精子洗滌液后300 g 離心5 min,棄上清,加0.5 ml 精子洗滌液重懸,37℃保存；③SU：1 ml 解凍精液+1.2 ml 培養液(在精液上方加入),離心管傾斜45°,37℃孵育1 h,保留上層培養液,300 g 離心5 min 后去上清,加0.5 ml 精子洗滌液重懸,37℃保存；④SW：1 ml 解凍精液+2 ml 精子洗滌液,混勻后300 g 離心5 min,棄上清,加0.5 ml精子洗滌液重懸,37℃保存。

1.4 觀察指標及判定標準

1.4.1 比較四組優選前后的精子總數、向前運動精子活率 統計、計算四組精子總數,并統以向前運動精子數量,高倍鏡下每份樣本統計精子數量至少200 個,重復統計2 次。

1.4.2 比較四組優選前后的精子形態學狀態 包括精子質膜完整率(伊紅-苯胺黑染色法)、精子DNA 完整率(瑞士染液染色法,高倍鏡下觀察500 個精子,精子頭部沒有光暈或較小光暈即包含DNA 碎片)。判定標準見圖1。

圖1 DNA 碎片判定標準

1.5 統計學方法 采用SPSS24.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四組優選前后的精子總數、向前運動精子活率比較 四組優選前的精子總數、向前運動精子活率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。四組優選后的精子總數均低于本組優選前,且C 組的精子總數低于A、B、D 組,B 組的精子總數低于A、D 組,差異具有統計學意義 (P＜0.05)；A 組與D 組的精子總數比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。優化后,A、D 組的向前運動精子活率低于本組優選前,B、C 組的向前運動精子活率高于本組優選前,且B、C 組的向前運動精子活率高于A、D 組,D 組的向前運動精子活率高于A 組,差異具有統計學意義 (P＜0.05)；B 組與C 組的向前運動精子活率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 四組優選前后的精子總數、向前運動精子活率比較()

表1 四組優選前后的精子總數、向前運動精子活率比較()

注：與本組優選前比較,aP＜0.05；與A 組優選后比較,bP＜0.05；與B 組優選后比較,cP＜0.05；與C 組優選后比較,dP＜0.05

2.2 四組優選前后的精子形態學狀態比較 四組優選前的精子質膜完整率、精子DNA 完整率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；四組優選后的精子質膜完整率、精子DNA 完整率均高于本組優選前,且A、B、C 組的精子質膜完整率、精子DNA 完整率均高于D 組,A 組的精子DNA 完整率高于B、C 組,差異具有統計學意義 (P＜0.05)。A、B、C 組的精子質膜完整率及B、C 組的精子DNA 完整率兩兩比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 四組優選前后的精子形態學狀態比較(,%)

表2 四組優選前后的精子形態學狀態比較(,%)

注：與本組優選前比較,aP＜0.05；與D 組優選后比較,bP＜0.05；與C 組優選后比較,cP＜0.05；與B 組優選后比較,dP＜0.05

3 討論

精子樣本解凍后優選結果,直接決定精子樣本質量及男性孕育能力。精子樣本冷凍時間延長、冷凍相關損傷均會在一定程度上造成精子損傷,出現質膜破碎、DNA 完整性喪失等,影響精液樣本質量,因此需在精液樣本解凍后進行樣本優選,以保證樣本質量［3,4］。

目前最常見的精液樣本優選方式為SW,具有操作簡單、處理時間短等優勢,但本次研究發現,在優選前后,無論在精子總數、運動形態或在形態學比較中,盡管對精液樣本起到一定的優化作用,但與其他三種優選方式相比,并未見明顯優勢。DGC 主要優選方式為,將精液中各種成分以不同密度溶液中自然分層平衡,從而分離出正常精子,此種優選方式操作相對簡單,且從本次研究結果看,在向前運動形態及形態學完整率比較中,DGC 均表現出較好優勢,提示了應用此種優選方式的臨床價值,但反復離心可能會對精子造成一定程度的損傷［5,6］。SU 主要依據精子活力進行優選,與以上兩種優選方式相比,此種優選方式主要優勢為應用純物理作用進行分離,對精子形態學完整性、向前運動活性影響較小,優選結果質量較高［7］。朱佳等［8］在對328例精子優選患者研究中發現,與Isolate 密度梯度法相比,DGC 精子活力顯著提升,考慮原因與優化期間精子狀態相關,與本次研究觀點一致。但此種方式優化所需時間長,精子回收率較低,長時間操作可能會造成精子損傷,影響最終優選質量。MACS為利用磁力吸附法,將膜聯蛋白V 與細小磁珠偶聯,并將精子混懸液與磁珠混勻孵育,當精子出現死亡后,其內部磷酯酰絲氨酸會暴露在外部,與磁珠吸附,此時應用MACS 分選柱可利用磁力吸附凋亡精子,以完成優選結果［9,10］。本次研究結果發現,此種優選方式在精子總數及精子形態結構比較中,均表現出良好性能,特別在DNA 完整率比較中優勢顯著,考慮與此種優選方式對質膜碎裂、出現DNA 片段篩選能力較高相關；但本次研究發現,以MACS 優選后,向前運動精子活率水平相對較低,考慮原因可能與此種方式操作步驟較多、操作時間相對較長有關,進而影響精子狀態。

綜上所述,冷凍精子優選中,MACS、DGC、SU、SW 法各具優勢,其中MACS 可提升精子形態學完整性,但影響精子活動狀態,DGC、SU 可保證精子運動狀態,且SU 可進一步提升精子活動能力,但兩者所獲精子總數相對較少,SW 操作簡單,且對精子質量起到一定的優化作用,說明四種優化方式各具優勢,因此在臨床冷凍精子優化方式選擇中,可結合實際需求、儀器設備等進行選擇。