蒙藥吉祥安坤丸對未成年雌性大鼠生殖發育及卵巢、子宮雌激素受體的影響

包春霞，富玉蘭，何烏云嘎，王秀蘭，奧·烏力吉

蒙藥吉祥安坤丸是蒙醫臨床上治療婦科疾病的首選藥物，由益母草、赤瓟子、木香、土木香、丁香、紅花等18味藥物配伍組成，具有調經活血，補氣安神之功效[1]。吉祥安坤丸在臨床上主要用于月經不調、痛經、絕經綜合征、異常子宮出血及乳腺增生等疾病的治療，且療效顯著。目前，對于吉祥安坤丸的研究主要圍繞臨床應用方面，藥理研究甚少。本實驗以未成年雌性大鼠為研究對象，給予不同劑量的吉祥安坤丸灌胃，對其傳統功效進行研究，為該藥在臨床上精確應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級未成年雌性SD大鼠36只，25日齡，體質量70～80 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司(遼寧省實驗動物資源中心)，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2020-0001。飼養于內蒙古民族大學SPF級動物房，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，適應性飼養3 d無異常的大鼠納入實驗。本實驗符合相關倫理學要求。

1.2實驗試劑與儀器 吉祥安坤丸(內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室，批號：內藥制字14060899)；卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睪酮(T)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-6(IL-6)酶聯免疫吸附試驗試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司；雌激素受體(ER)免疫組織化學試劑盒購自中國Affinity公司；95%乙醇和甲醛溶液均購自天津市大茂化學試劑廠；Cole氏蘇木素染色液購自北京索萊寶科技有限公司；署紅Y購自國藥集團化學試劑有限公司；NIKON Eclipes顯微鏡購自上海土森視覺科技有限公司；eppendorf離心機購自廣州吉源生物科技有限公司；TECAN SPARK多功能酶標儀購自上海閃譜生物科技發展有限公司；DP73顯微鏡拍照系統購自日本OLYMPUS公司。

1.3動物分組與給藥 將未成年雌性SD大鼠隨機分為低、高劑量組和對照組，每組12只。低、高劑量組分別給予1.0、2.0 g/(kg·d)吉祥安坤丸混懸液灌胃，對照組給予等體積蒸餾水灌胃，3組均連續給藥21 d。

1.4觀察指標及方法

1.4.1體質量及臟器系數：各組大鼠每4天稱量體質量，給藥21 d后，采用陰道細胞涂片觀察發情周期，選擇動情間期處理大鼠，稱量體質量。每組隨機選取8只大鼠按1～8的順序編號，麻醉后腹主動脈取血，室溫放置30 min后，以3000 r/min離心10 min，收集上清液，于-80 ℃冷凍保存。采血后取大鼠卵巢和子宮，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱量卵巢和子宮濕質量，然后用4%甲醛固定。計算其臟器系數，臟器系數(%)=臟器濕質量(g)/體質量(g)×100%。

1.4.2發情周期陰道細胞涂片觀察：各組大鼠給藥最后10 d每天8：00～8：30做陰道涂片，暴露陰道后，用蘸有少許生理鹽水的無菌小棉簽，緩慢置于大鼠陰道內，輕輕旋轉，然后將蘸取的陰道細胞均勻涂在載玻片上，待涂片稍干后，用95%乙醇固定，HE染色后光學顯微鏡下觀察，連續觀察2個發情周期。發情周期4～5 d為正常，<4 d或>5 d均為發情周期紊亂，<4 d為發情周期縮短，>5 d為發情周期延長[2]。發情周期紊亂率=每組發情周期紊亂大鼠只數/每組大鼠總只數×100%。

1.4.3血清性激素及細胞因子測定：采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清FSH、LH、E2、PROG、T、IGF-Ⅰ、VEGF、TNF-α及IL-6水平。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度。

1.4.4卵巢和子宮組織ER的表達：采用免疫組織化學法檢測。稱量卵巢、子宮質量，用質量分數為40 g/L的甲醛固定，常規制片，厚約50 μm，進行免疫組織化學染色程序后封片，運用Image J軟件進行定量分析卵巢和子宮組織ER的表達情況。平均光密度(AOD)=累積光密度(IOD)/面積。

2 結果

2.1吉祥安坤丸對體質量及卵巢、子宮系數的影響 3組體質量和卵巢系數比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，低劑量組子宮系數下降，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，而高劑量組子宮系數明顯上升(P<0.05)。表明未成年雌性大鼠子宮可能為吉祥安坤丸的靶器官。見圖1。

圖1 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組體質量及卵巢、子宮系數比較

2.2吉祥安坤丸對發情周期的影響 通過觀察陰道細胞涂片判斷大鼠發情周期，動情前期以有核上皮細胞為主；動情期以角化上皮細胞為主，呈“落葉狀”堆積或相互連接成片；動情后期以角化上皮細胞、有核上皮細胞和白細胞為主，3種細胞數量差異不大；動情間期以白細胞為主[3]。見圖2。對照組發情周期延長7只、未發情1只，發情周期紊亂率為100.0%；低劑量組發情周期延長1只、正常7只，發情周期紊亂率為12.5%；高劑量組發情周期延長4只、正常4只，發情周期紊亂率為50.0%；與對照組比較，低、高劑量組發情周期紊亂率明顯下降(P<0.05，P<0.01)，但低、高劑量組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。表明吉祥安坤丸能改善發情周期。

圖2 未成年雌性SD大鼠發情各期的陰道細胞涂片(HE ×40)

2.3吉祥安坤丸對血清性激素的影響 3組血清FSH和T水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，高劑量組血清LH、E2、PROG水平均明顯升高，低劑量組血清LH水平也明顯升高(P<0.05，P<0.01)。表明吉祥安坤丸對卵泡的發育及排卵有一定的促進作用。見表1。

表1 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組血清性激素水平比較

2.4吉祥安坤丸對血清細胞因子的影響 與對照組比較，低、高劑量組血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；而VEGF、IL-6水平有上升趨勢，IGF-Ⅰ水平有下降趨勢，但3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。表明吉祥安坤丸可能對炎性因子具有抑制作用。見表2。

表2 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組血清細胞因子水平比較

2.5吉祥安坤丸對卵巢和子宮組織ER表達的影響 光鏡下可見，ER蛋白不同程度地表達于低、高劑量組和對照組卵巢顆粒細胞和子宮組織中。見圖3和4。圖像分析結果顯示，與對照組比較，低劑量組卵巢和子宮組織ER表達水平明顯升高，高劑量組子宮組織ER表達水平明顯上升(P<0.05)。表明吉祥安坤丸能促進卵巢、子宮組織中ER的表達。見表3。

圖3 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組卵巢組織雌激素受體表達情況

圖4 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組子宮組織雌激素受體表達情況

表3 不同劑量吉祥安坤丸處理未成年雌性SD大鼠3組卵巢和子宮組織ER表達水平比較

3 討論

蒙藥吉祥安坤丸又名烏力吉-18味丸，出自蒙醫藥經典著作《觀者之喜》，由益母草、赤瓟子、木香、土木香等18味藥物組成，方中以活血、調經的益母草和破血痞及治療陰道疾患的赤瓟子為主藥，輔以木香、土木香調和氣血，佐以丁香理氣、紅花清血熱，加以沙棘、山奈、硼砂活血化瘀、破癖，以小白蒿、刺柏葉、熊膽鎖脈止血；又佐以鹿茸、冬蟲夏草補益經血、強筋壯骨；以牛黃、朱砂清熱鎮靜；以長喙訶子、五靈脂祛痹、調和體素。該方用以治療婦女氣血相搏、月經不調、腰骶關節痛、頭痛、多汗、周身沉重、四肢水腫、產褥熱、乳腺腫脹等諸癥，故為治療婦科疾病首選之藥[4]。蒙醫臨床上應用廣泛，療效明確。

未成年雌性大鼠發情周期受日漸成熟的下丘腦-垂體-卵巢軸支配。生理狀態下，卵巢在周期性的排卵和分泌相應性激素的同時，還伴隨陰道上皮細胞周期性變化及脫落。據研究報道，大鼠發情周期中陰道脫落細胞形態結構變化主要受雌激素水平變化的影響，E2分泌不足，會造成發情周期延長和動情期縮短，故發情周期紊亂可以作為反映性激素分泌是否失衡的指標[5]。本實驗結果顯示，吉祥安坤丸明顯升高未成年雌性大鼠血清E2水平，并改善大鼠的發情周期。該結果與吉祥安坤丸調經活血之傳統功效完全吻合。

細胞因子是影響女性生殖系統生理和病理過程的重要因素。近年來，細胞因子已成為生物醫學領域研究的熱點。IGF-Ⅰ是由生長激素刺激肝臟產生的一類廣譜性促生長因子，其生物學作用廣泛，能模擬生長激素的某些生物學效應，促進細胞增殖和分化，抑制細胞凋亡，還具有類似胰島素的代謝活性及免疫調節作用，是反映生長激素生物功能的靈敏指標[6-7]。VEGF是重要的血管形成因子和血管通透因子，由內皮細胞和子宮內膜中的巨噬細胞產生。近來研究發現，VEGF參與調節子宮內膜的生長、胚胎的發育、卵巢血管的生成及腫瘤的生長，在女性生殖功能方面起著重要的作用[8-9]。TNF-α和IL-6是機體重要的炎性因子，具有促進炎癥反應及免疫調節作用，也是機體炎癥反應的重要介質。有研究表明，當女性生殖器官感染時，血清TNF-α和IL-6的含量明顯升高[10]。本實驗結果顯示，吉祥安坤丸對血清VEGF、IGF-Ⅰ水平無明顯影響，但能明顯降低血清TNF-α水平。一項吉祥安坤丸藥理研究結果表明其具有抗炎作用[11]，而本實驗明確了吉祥安坤丸具有抑制炎性因子作用。由此可見，吉祥安坤丸對女性生殖器官感染可能有一定的療效。

人類生殖功能是機體內外各種因素綜合調控的結果，而起主要調控作用的是下丘腦-垂體-性腺軸，其生理功能正常是維持女性性腺生殖功能的重要保證[12-15]。腺垂體能夠分泌促性腺激素FSH和LH，FSH促進女性卵泡發育，且在LH協同作用下使卵泡分泌雌激素和孕激素，PROG通常在E2作用的基礎上發揮作用，可限制子宮內膜增生，使增生期內膜轉化為分泌期[16-18]。另外，女性進入青春期后，卵巢開始分泌雌激素，與靶器官的ER結合，促進陰道、子宮、輸卵管及卵巢的發育，同時促使子宮內膜增生而產生月經。目前研究表明，青春期異常子宮出血原因在于性腺發育不成熟，雌激素分泌呈持續低水平，導致無排卵，致使缺乏PROG對子宮內膜增生的拮抗，使子宮內膜漸進性增生過度，導致不規律出血、崩漏[19]。本研究結果顯示，吉祥安坤丸對未成年雌性大鼠血清FSH無顯著影響，但能夠明顯升高血清LH、E2、PROG水平及子宮系數，對卵巢、子宮組織ER的表達也有一定的促進作用，故而推測吉祥安坤丸對卵泡發育及排卵有一定的促進作用，并對子宮發育也有一定的影響，其機制可能與調節子宮、卵巢組織ER有關，有待進一步研究證實。吉祥安坤丸在歷代傳統蒙醫經典書籍中均有記載，由于其傳承有別，各地區對此方藥用量不同而出現臨床療效不同。本實驗中，高劑量組子宮系數、血清LH、E2、PROG水平及子宮組織ER表達水平明顯升高，而低劑量組只有血清LH水平及卵巢和子宮組織ER表達水平升高，而對血清E2、PROG水平無明顯影響，故認為高劑量組的作用較低劑量組更優。

本實驗從吉祥安坤丸對未成年雌性大鼠發情周期、性激素、細胞因子、臟器系數及卵巢和子宮ER表達的影響入手，對其藥理藥效進行基礎研究，結果提示吉祥安坤丸能明顯升高未成年雌性大鼠血清LH、E2、PROG水平及卵巢、子宮組織ER表達水平，降低血清TNF-α水平，并改善發情周期。本研究為后續吉祥安坤丸傳統功效的作用機制研究，提供了一種新的思路與方法。