COPD合并肺炎患者產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型分析

白 燕，辜依海，劉玥彤，余宏鑫，賀 凡，孫德琴

肺炎是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)常見的并發癥，同時也是導致COPD患者死亡的重要誘因[1]。流行病學調查顯示，COPD患者合并肺部感染的發生率為3.9%，而肺部感染會使COPD患者病情進一步加重，其中細菌感染在COPD病情惡化過程中起著極其關鍵的作用[2]。肺炎克雷伯菌是COPD合并肺炎常見的致病菌，而隨著抗生素在臨床的大面積使用，肺炎克雷伯菌的耐藥性不斷升高，其中最重要的因素就是大量產生超廣譜β-內酰胺酶(ESBLS)[3]。相關研究發現，不同地區的產ESBLS肺炎克雷伯菌存在一定的差異，其基因型并不相同，從而反映其耐藥機制的復雜多樣[4]。為詳細了解COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌的耐藥性及其基因型，本研究通過對COPD合并肺炎患者的痰液標本進行細菌培養和鑒定，并分析產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分布情況，旨在為臨床合理選擇抗感染藥物治療COPD合并肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月—2020年1月我院收治的328例COPD合并肺炎作為研究對象，其中男201例，女127例；年齡45～72(60.91±8.36)歲；COPD病程5～16(11.58±2.31)年；來源于門診33例，來源于住院病房295例。

1.2方法

1.2.1細菌培養、鑒定及藥敏試驗：采用一次性吸痰管收集所有患者的痰液標本，立即置于無菌管中，按照《全國臨床檢驗操作規程》[5]中的方法進行細菌培養。使用API全自動微生物鑒定系統進行細菌鑒定，儀器購自法國生物梅里埃股份有限公司。Mueller-Hinton瓊脂培養平板購自杭州天和微生物試劑有限公司。使用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏試紙購自北京天壇藥物生物技術開發公司。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603及大腸埃希菌ATCC25922。選擇氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、氨芐西林/舒巴坦、復方新諾明、慶大霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、美羅培南及亞胺培南進行藥敏試驗。

1.2.2ESBLS檢測：使用雙紙片法及表型確證試驗對肺炎克雷伯菌是否產ESBLS進行檢測。應用無菌生理鹽水稀釋標本菌株懸濁液，直至0.5麥氏單位濁度，并且均勻地涂布于Mueller-Hinton瓊脂培養平板上面；然后將30 μg的頭孢他啶紙片、30 μg/10 μg的頭孢他啶/克拉維酸紙片、30 μg的頭孢噻肟紙片、30 μg/10 μg的頭孢噻肟/克拉維酸紙片置于Mueller-Hinton瓊脂培養平板上面；35 ℃條件下孵育16～18 h；測量頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片，以及頭孢他啶/克拉維酸紙片、頭孢噻肟/克拉維酸紙片的抑菌環直徑，若頭孢他啶/克拉維酸紙片、頭孢噻肟/克拉維酸紙片的抑菌環直徑分別較頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片抑菌環直徑的擴大值≥5 mm，則明確為產ESBLS菌株。

1.2.3ESBLS基因型檢測：首先，對產ESBLS肺炎克雷伯菌進行培養；然后提取產ESBLS肺炎克雷伯菌總DNA，再應用PCR法分析產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。PCR反應體系包括0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、1×PCR緩沖液以及100 ng DNA模板，總反應體積為25 μl；PCR反應程序為94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min、72 ℃延伸10 min，共25個循環。ESBLS基因型包括質粒誘導酶(TEM)、β-內酰胺耐藥相關酶(SHV)、頭孢噻肟酶(CTX-M)、鄰氯青霉素水解酶(OXA)，各基因型引物序列見表1。

表1 ESBLS基因型引物序列

1.3觀察指標 ①統計COPD合并肺炎患者肺炎克雷伯菌檢出率；②記錄COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌對常用抗生素的耐藥性；③分析COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。

1.4統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件處理數據。耐藥性檢測結果、基因型分析結果等計數資料以率(%)表示。

2 結果

2.1肺炎克雷伯菌檢出率 收集COPD合并肺炎患者痰液標本共328份，培養出病原菌131株，分離出肺炎克雷伯菌93株，共檢出產ESBLS肺炎克雷伯菌48株，檢出率為51.61%。

2.2產ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥性檢測 藥敏試驗發現，COPD合并肺炎患者檢出的48株產ESBLS肺炎克雷伯菌對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶的耐藥率均為100%；對氨芐西林/舒巴坦、復方新諾明耐藥率均>60%，分別為68.75%和60.42%；對慶大霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、呋喃妥因和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為39.58%、35.42%、35.42%、29.17%和20.83%；對阿米卡星的耐藥率為8.33%，敏感性為91.67%；對亞胺培南和美羅培南耐藥率均為0，敏感性為100%。

2.3產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析 通過PCR法對48株產ESBLS肺炎克雷伯菌進行基因型分析，結果顯示，3株為單基因型，其余為雙基因型或多基因型，占比93.75%；48株產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型以SHV、CTX-M-1為主，分別為38株(79.17%)、36株(75.00%)，基因型TEM、CTX-M-9、CTX-M-2、CTX-M-3、OXA分別為22株(45.83%)、11株(22.92%)、4株(8.33%)、3株(6.25%)、2株(4.17%)。見表2和圖1。

表2 COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析(n=48)

圖1 部分ESBLS基因型PCR擴增產物電泳圖

3 討論

COPD是一種全球負擔巨大且日益嚴重的呼吸系統疾病，居全球死因的第三位[6-8]。肺部感染是導致COPD急性發作的重要因素，革蘭陰性菌是COPD合并肺炎的主要病原菌[9-11]。一項關于COPD合并下呼吸道感染病原菌分布和耐藥性的回顧性分析也發現，其主要病原菌為革蘭陰性菌，且以肺炎克雷伯菌的檢出率最高，占比30.3%[12]。但近年來，肺炎克雷伯菌由于產ESBLS而容易出現耐藥性[13]。肺炎克雷伯菌耐藥性增高不僅會使抗感染治療失敗，延長住院時間，增加經濟負擔，還會提升患者病死率[14-15]。

本研究結果顯示，采集328份COPD合并肺炎患者痰液標本培養出病原菌131株，并分離出肺炎克雷伯菌93株，共檢出產ESBLS肺炎克雷伯菌48株，檢出率為51.61%，與相關文獻報道相似[16-17]，但檢出率較唐雯娟等[18]報道的29.57%及劉勇等[19]報道的37.65%明顯升高。考慮與COPD患者免疫力較差，以及持續、大劑量地使用抗生素有關。提示COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌現狀已發展到較為嚴重的階段，此問題迫切需要解決。本研究進一步藥敏試驗發現，COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌除對亞胺培南、美羅培南、阿米卡星敏感性>90%以外，已對大部分的抗生素表現出耐藥性，對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率最高，達100%，其次為氨芐西林/舒巴坦、復方新諾明，耐藥率均>60%，對慶大霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦均表現出不同程度的耐藥。具體而言，產ESBLS可能是肺炎克雷伯菌對大部分頭孢菌素類藥物產生耐藥性的主要原因，如若長時間、高劑量地應用頭孢菌素類藥物，在藥物的作用下，細菌ESBLS的產酶量將明顯升高，從而造成肺炎克雷伯菌產生新的耐藥性[20]。而肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素藥物敏感性為100%，可能與此類藥物對酶穩定性較好，且不容易被ESBLS所破壞存在關聯，但隨著碳青霉烯類抗生素不斷地被臨床經驗性使用，其耐藥性也在逐漸增加[21]。因此，針對產ESBLS肺炎克雷伯菌，選擇抗生素時應當十分慎重。

本研究鑒定的48株產ESBLS肺炎克雷伯菌中，雙基因型或多基因型占比93.75%，且以SHV、CTX-M-1基因型檢出率最高，TEM、CTX-M-9次之，最后為CTX-M-2、CTX-M-3、OXA，與楊燕文等[22]報道的結果類似。表明產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型呈現多樣性，含多種產β-內酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌耐藥譜更寬，另外還可以通過質粒介導而使多重耐藥菌傳播與流行。基于COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌基因型的復雜性及多樣性，甚至呈現區域性流行狀況，故不同地區需要加強對本地菌株耐藥性的監測，從而及時預防、控制COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥性蔓延，并指導合理選擇抗生素治療。

綜上所述，COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥狀況控制差，菌株攜帶多種耐藥基因現象較嚴重，需要引起高度重視。了解COPD合并肺炎患者產ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥狀況以及菌株基因型分布，有利于預測COPD合并肺炎患者對抗生素的耐藥趨勢，進而指導臨床合理應用抗生素進行治療。