基于TGF-β1/Smads信號通路探討肩袖損傷肌腱止點處異常骨重塑的機制研究

孫孝月 ,李亦丞,劉 陽,岐 飛 ,孫學斌

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院運動醫(yī)學科，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)外科，烏魯木齊 830054

肩袖損傷是一種常見的肩關節(jié)運動損傷疾病，其發(fā)病率占肩關節(jié)疾病17%～41%，其中岡上肌損傷最為常見[1]。目前，肩關節(jié)鏡下肩袖修補術是修復肩袖損傷最常用、最有效的治療方法[2]。然而，術區(qū)縫合錨釘在康復訓練過程中易出現(xiàn)脫出以及置入位點處骨折等并發(fā)癥，而且此類問題的處理極為棘手[3]。因此，深入探究肩袖損傷后肌腱止點處異常病理機制勢在必行。

研究發(fā)現(xiàn)慢性肩袖損傷患者的肱骨大結(jié)節(jié)處出現(xiàn)異常骨囊腫或骨硬化病理表現(xiàn)[4]，而這將嚴重影響肩袖修復錨釘?shù)目p合強度，減少錨釘與骨組織的接觸面積，進而導致脫錨等并發(fā)癥發(fā)生。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)當肌腱損傷后止點處出現(xiàn)異常骨重塑，該病理機制與TGF-β信號通路高度相關。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是該家族中活性最強的蛋白多肽，超過90%，在全身廣泛分布，在組織形成、維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[6]。TGF-β1在調(diào)節(jié)骨代謝功能方面發(fā)揮不可替代作用，當關節(jié)受到異常機械應力刺激時，埋藏于骨基質(zhì)中的TGF-β1釋放增加，破壞軟骨下骨原有的梯度導致異位成骨。異常增加的TGF-β1破壞正常生理狀態(tài)下受到規(guī)律調(diào)控的骨重塑，使得骨的合成和吸收形成失偶聯(lián)[7]。盡管描述了TGF-β1在異常骨重塑中的作用，但TGF-β1在肩袖損傷肌腱止點處異常骨重塑中所扮演的角色尚不清楚。

本實驗研究采用SD大鼠動物制造岡上肌肌腱止點處斷裂構(gòu)建肩袖損傷模型，通過染色、免疫組織化學等組織學方法探討TGF-β1信號通路是否參與肩袖損傷肌腱止點處異常的骨重塑的病理機制，為臨床研究治療肩袖損傷疾病提供新的靶點。

材料與方法

1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠40只，12周齡，體質(zhì)量指數(shù)(450±30)g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(新)2018-0002。實驗內(nèi)容、方法及動物福利等均已獲得新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(IACUC20191018-14)。

2 主要試劑與儀器

HE染料(中國索萊寶公司)；番紅固綠染液(美國Sigma公司)；TGF-β1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；Smad2/3抗體(美國Santa Cruz生物技術公司)；成骨轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)抗體(美國Abcam 公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒、血小板-內(nèi)皮細胞黏附因子(CD31)抗體均購自中國賽維爾生物科技有限公司;組織脫水機(型號：ASP300S)、石蠟包埋機(型號：EG1150)、病理切片機(型號：RM2135)均購自德國LEICA公司。

3 實驗方法

3.1肩袖損傷模型制備 在動物實驗平臺上鋪無菌手術單，SD大鼠采用腹腔注射給予戊巴比妥鈉溶液(5mg/100g)進行麻醉，麻醉后進行右肩關節(jié)備皮，消毒皮膚。大鼠取左側(cè)臥位，縱行切開右側(cè)上肢皮膚2～4cm，暴露肩胛區(qū)上部及上臂肌肉，找到斜方肌附著部并切開此部肌肉，向上翻開即可看見岡上肌。分離岡上肌起止點間，切斷少許三角肌充分暴露岡上肌肌腱止點與肱骨大結(jié)節(jié)連接處，鈍性離斷岡上肌肌腱在肱骨大結(jié)節(jié)附著部位。由于本實驗是為了制造肩袖損傷模型，故不逐層縫合，標準條件下飼養(yǎng)動物。見圖1。

圖1 SD大鼠動物肩袖損傷模型制備示意圖。a.暴露岡上肌肌腱止點；b.切斷岡上肌肌腱止點；c.心臟取血；d.樣本取材

3.2動物實驗分組 按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組術后14、30、60d組，各10只。正常組肩關節(jié)不作任何手術操作正常飼養(yǎng)，模型組術后14、30、60d右肩關節(jié)在岡上肌肌腱止點與肱骨大結(jié)節(jié)連接處行岡上肌肌腱切斷術建立肩袖損傷模型，造模后于術后14、30和60d人道處死所有動物取右肩關節(jié)保留關節(jié)囊。見圖1。

所有動物正常飼養(yǎng)，可飲水攝食，籠內(nèi)正常活動。各組動物均先采用鎮(zhèn)靜和麻醉劑輔助實施安樂死注射，處死前需心臟取全血。從腹部剪開，注意不要剪到臟器，剪破橫隔后暴露心臟，輸液皮條針頭從心尖快速插入，隨后依次完成快速全身灌注，灌注液為生理鹽水和4%組織固定液，待SD大鼠尾巴僵直后，取材。

4 觀察指標

4.1HE染色觀察軟骨組織病理改變情況 取大鼠右側(cè)保留關節(jié)囊的肩關節(jié)置于組織固定液中，固定24h，使用10%EDTA-2Na溶液脫鈣28d，標本脫水、石蠟包埋；于岡上肌與肱骨大結(jié)節(jié)冠狀面切片機連續(xù)切片，厚度為4μm；帶有標本的載玻片放置烤箱中常規(guī)脫蠟烤片至過夜，以備日后使用。取各組切片行常規(guī)HE染色，放置烤箱烘烤1h，脫蠟梯度乙醇分化，HE染色7min，水洗，1%鹽酸溶液分色10s，水洗返藍；伊紅染色1min，梯度乙醇脫水，浸入透明液，晾干后中性樹膠封片。完成HE染色后，光學顯微鏡下觀察關節(jié)軟骨組織的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，測量鈣化軟骨和透明軟骨的厚度，判斷潮線是否上移，和病理性改變的程度。

4.2SO-FG染色觀察軟骨組織退變程度 取每組部分切片，常規(guī)烤箱烘烤后浸入脫蠟液中，梯度乙醇分化至水，HE染色1min，水洗：0.2%固綠染液5min，1%冰乙酸10s，0.1%番紅O染液5min，水洗：隨后置于95%乙醇10s，透明液5min，晾干后中興樹膠封片。完成SO-FG染色后，光學顯微鏡下觀察關節(jié)軟骨組織破壞情況。

4.3TRAP染色觀察軟骨下骨破骨細胞活化程度 取每組載玻片放入烤箱烤片，常規(guī)脫蠟乙醇梯度，根據(jù)TRAP染色試劑盒生產(chǎn)說明書處理4組大鼠切片，然后用甲基綠染液進行復染，晾干后中性樹膠封片。通過TRAP試劑盒染色后，光學顯微鏡下觀察軟骨下骨中破骨細胞表達情況并進行定量分析。

4.4免疫組織化學法檢測TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31表達量 按照免疫組織化學試劑盒生產(chǎn)說明進行實驗流程，取帶有組織標本的中杉陽離子防脫載玻片，過夜烤片，載玻片浸入脫蠟液梯度乙醇最后至水；3%過氧化氫(H2O2)溶液室溫靜置15min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，TBST洗3遍，每次5min；0.4%胃蛋白酶放置37℃孵育箱30min抗原修復，TBST洗3遍，每次5min；移液槍滴加山羊血清封閉液40μL，放置37℃孵育箱25min，滴加TGF-β1(1∶100)、p-Smad2/3(1∶40)、Osterix(1∶400)、CD31(1∶400)抗體40μL，4℃冰箱過夜；次日常溫40min，TBST洗3次，每次5min；滴加山羊抗兔二抗37℃孵育箱25min，TBST洗3次，每次5min；移液槍滴加DAB顯色劑40μL，顯微鏡下觀看組織輪廓由無色漸變?yōu)樽攸S色立即放入蒸餾水中終止顯色；HE染色3min后置于水中清洗，鹽酸乙醇溶液1s，PBS溶液中返藍；梯度乙醇后浸入透明液，晾干后中性樹膠封片。完成免疫組織化學法后，采用GraphPad Prism 8軟件對軟骨下骨中TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31表達量數(shù)值進行處理。

5 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 軟骨組織病理改變

正常組：關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，細胞排列分層整齊有序，形態(tài)規(guī)則，軟骨細胞核呈藍紫色；透明軟骨厚度>鈣化軟骨厚度，潮線清晰；模型組術后14d：關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)較正常，細胞排列紊亂部分分布不均，透明軟骨厚度>鈣化軟骨厚度；模型組術后30d：關節(jié)軟骨內(nèi)細胞紊亂且部分密度不均勻，透明軟骨厚度<鈣化軟骨厚度，潮線上移；模型組術后60d:關節(jié)軟骨內(nèi)細胞排列紊亂，鈣化軟骨明顯增厚，透明軟骨厚度<鈣化軟骨厚度，潮線顯著上移。與正常組相比，模型組術后30、60d透明軟骨厚度均減小，鈣化軟骨厚度均增加，潮線上移(P<0.05)；模型組術后14d透明軟骨厚度和鈣化軟骨厚度與正常組結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、表1。

表1 各組透明軟骨和鈣化軟骨厚度比值比較

圖2 各組軟骨組織厚度改變圖(HE，×100)。a.正常組：關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，透明軟骨厚度大于鈣化軟骨厚度；b.模型組術后14d：關節(jié)軟骨內(nèi)細胞排列紊亂部分分布不均，透明軟骨厚度大于鈣化軟骨厚度；c.模型組術后30d：關節(jié)軟骨內(nèi)細胞紊亂且密度分布不均，透明軟骨厚度小于鈣化軟骨厚度；d.模型組術后60d：關節(jié)軟骨內(nèi)細胞排列紊亂，鈣化軟骨明顯增厚，潮線顯著上移(圖中HC為透明軟骨，CC為鈣化軟骨)

2 軟骨組織退變程度

SO-FG染色結(jié)果顯示：正常組大鼠關節(jié)表面結(jié)構(gòu)完整，軟骨細胞整體排列有序，番紅染色著色較深；模型組術后軟骨細胞排列紊亂，番紅著色逐漸較淺，表明軟骨基質(zhì)丟失，異常骨質(zhì)形成。見圖3。

圖3 各組軟骨組織病理學改變圖(SO-FG，×200)。a.正常組：關節(jié)軟骨表面結(jié)構(gòu)完整，番紅著色較深；b.模型組術后14d：關節(jié)軟骨內(nèi)僅有少量番紅染色缺失；c.：模型組術后30d：關節(jié)軟骨內(nèi)部分番紅著色較淺；d.模型組術后60d：關節(jié)軟骨內(nèi)大面積番紅染色缺失

3 肩袖止點處破骨細胞活化程度

TRAP染色結(jié)果顯示：軟骨下骨中破骨細胞表達量在模型組14d顯著升高，并維持較高水平于術后30d，最終在術后60d恢復至正常水平。模型組術后14、30d破骨細胞表達量高于正常組(P<0.05)；與正常組比較，模型組術后60d破骨細胞表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖4 肩袖止點處破骨細胞活化程度圖(TRAP，×50)。a.正常組：軟骨下骨中破骨細胞表達較少；b.模型組術后14d：軟骨下骨中破骨細胞表達顯著增多；c.模型組術后30d：軟骨下骨中破骨細胞表達較正常組明顯增多；d.模型組術后60d：軟骨下骨中破骨細胞表達量較少(黑箭頭所示為破骨細胞)

圖5 各組肩袖止點處破骨細胞定量分析圖。與正常組比較：*P<0.05

4 肩袖止點處參與異常骨重塑的TGF-β1/Smad2/3信號通路的變化

免疫組織化學染色顯示：TGF-β1、p-Smad2/3陽性細胞表達量在模型組術后14、30d中均顯著高于正常組(P<0.05)；與正常組比較，TGF-β1、p-Smad2/3陽性細胞表達量在模型組術后60d TGF-β1、p-Smad2/3陽性細胞表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Osterix陽性細胞表達量在模型組術后14、30、60d中呈現(xiàn)遞增形式，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD31陽性細胞表達量在模型組術后14、30、60d顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6、7。

圖6 各組軟骨下骨中TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31表達情況(免疫組織化學法，×50)。a.正常組：TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31生物學因子陽性細胞表達最少；b.模型組術后14d：TGF-β1和p-Smad2/3生物學因子陽性細胞表達最多；c.模型組術后30d：TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31生物學因子陽性細胞表達較正常組陽性細胞表達較多；d.模型組術后60d：Osterix和CD31生物學因子陽性細胞表達最多

圖7 各組軟骨下骨中TGF-β1、p-Smad2/3、Osterix及CD31因子定量分析圖。a.正常組；b.模型組術后14d；c.模型組術后30d；d.模型組術后60d。與正常組比較：*P<0.05

討 論

目前探究肩袖損傷的病理機制在肌腱病的組織病理學方面研究較多[8-9]，但在肩袖肌腱止點處骨重塑研究較少。肩袖是由岡上肌、岡下肌、小圓肌和肩胛下肌組成的一組肌群，四組肌群呈套袖樣包繞在肩關節(jié)周圍，止于肱骨頭大小結(jié)節(jié)處[10]。其中岡上肌損傷最為常見[1]，岡上肌止點即肱骨大結(jié)節(jié)處，因此本研究采用離斷岡上肌肌腱止點構(gòu)建肩袖損傷模型。動物實驗模型是研究疾病病理機制以及預防的必要條件，由于SD大鼠肩關節(jié)解剖結(jié)構(gòu)被認為與人類最為相似[11]，常用于肩袖損傷機制的研究。因此本研究采用SD大鼠離斷岡上肌肌腱止點處，與肱骨大結(jié)節(jié)處分離開，構(gòu)建肩袖損傷模型。

正常骨組織重塑是由成骨細胞和破骨細胞之間通過偶聯(lián)作用完成的，成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收之間的平衡維持了骨穩(wěn)態(tài)[12-13]。在異常骨重塑中，破骨細胞與成骨細胞偶聯(lián)機制失調(diào)，破骨細胞急劇增加，埋藏在骨基質(zhì)中TGF-β1被釋放出髓腔當中，髓腔里的間充質(zhì)干細胞(MSC)感受眾多高濃度TGF-β1后，通過趨化作用，將MSC募集于骨吸收處，導致非偶聯(lián)重建最終形成骨島[14]。近期有研究發(fā)現(xiàn)異常骨重塑中活化的破骨細胞引起過度的骨吸收，可能參與骨質(zhì)疏松、類風濕關節(jié)炎等不同骨疾病的發(fā)病機制[15-16]。Logar等[17]分析了骨關節(jié)炎和伴有骨質(zhì)疏松的髖關節(jié)骨折組織中破骨細胞標記物(TRAP)的表達，發(fā)現(xiàn)與骨折組相比較，TRAP的表達呈上升趨勢。Auréal等[18]對類風濕關節(jié)炎在局部骨丟失病理生理學方面進行綜述，在類風濕性關節(jié)炎患者骨侵蝕部位發(fā)現(xiàn)大量破骨細胞，表明破骨細胞在關節(jié)骨質(zhì)退化起著關鍵性作用。值得注意的是，本研究切斷岡上肌肌腱止點后，通過TRAP染色發(fā)現(xiàn)在軟骨下骨骨吸收異常活躍，模型組術后14d破骨細胞大量活化表現(xiàn)驟升趨勢，直到術后60d恢復至正常水平，同時異常骨吸收活躍使得骨基質(zhì)中TGF-β1大量釋放，在軟骨下骨中TGF-β1和p-Smad2/3分子陽性細胞表達量隨破骨細胞的數(shù)量變化而變化。Osterix作為成骨前體細胞的標記物，也隨著破骨細胞變化而變化，Osterix陽性細胞數(shù)量在術后模型組保持著較高水平，表明軟骨下骨中骨的吸收和形成異常活躍，這種異常增加的活性可能會使軟骨下骨異常骨重塑加快，進而導致病理機制的發(fā)生。

此外，關節(jié)軟骨和軟骨下骨作為肩關節(jié)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，關節(jié)軟骨又位于軟骨下骨上方，其兩者之間相互作用，同時維持著骨重塑內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[19]。當軟骨下骨發(fā)生異常骨重塑時關節(jié)軟骨也發(fā)生著病理學改變。本研究通過HE染色結(jié)果顯示，在模型組術后30、60d關節(jié)軟骨內(nèi)出現(xiàn)細胞紊亂且部分密度不均勻、透明軟骨厚度減小，鈣化軟骨增厚及潮線顯著上移病理學改變。此外，本研究通過SO-FG染色結(jié)果得出，離斷肩袖岡上肌止點構(gòu)建肩袖損傷模型組，隨著時間術后14、30、60d增加，大鼠關節(jié)軟骨內(nèi)番紅著色逐漸較淺，表明軟骨基質(zhì)丟失逐漸嚴重，異常骨質(zhì)形成。另一項研究顯示，在異常骨重塑過程中，會伴隨著微血管的形成[20]。在本研究中觀察術后模型組CD31表達量逐漸增加，這與Lotz[21]發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎的病理改變中包括軟骨下骨血管形成的增加結(jié)果一致，由此可見，在異常骨重塑中往往伴隨著異常血管生成。

綜上所述，筆者在離斷岡上肌肌腱止點構(gòu)建肩袖損傷模型中觀察到肌腱止點處發(fā)生異常骨重塑，關節(jié)軟骨和軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，這可能是術后康復訓練中術區(qū)錨釘脫出發(fā)生再次損傷的原因。本研究證實，TGF-β1信號通路參與肩袖損傷肌腱止點處異常骨重塑的病理機制，但本研究中還存在不足之處，沒有找到治療靶點來驗證通過Smad2/3介導的轉(zhuǎn)化生長因子β1信號通路參與肩袖損傷肌腱止點處異常骨重塑的病理機制，未來將會繼續(xù)深入探究。

作者貢獻聲明：孫孝月：研究實施、數(shù)據(jù)收集、論文撰寫及修改；李亦丞：統(tǒng)計學分析、實驗實施、數(shù)據(jù)分析(收集)；岐飛:實驗操作、動物飼養(yǎng)；劉陽、孫學斌：研究指導、論文指導及修改、經(jīng)費支持