高通量測序分析羊肚菌—赤松茸輪作土壤微生物群落結構變化

鄧瑩蓮，趙長林

（西南林業大學 生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224）

0 引言

羊肚菌（Morchellaspp.）是在全球廣泛分布的一類珍貴食（藥）用真菌，隸屬子囊菌門Ascomycota、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），具有重要的經濟和藥用價值［1］。現代醫學研究證實，羊肚菌具有調節機體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多種生物活性［2］。近年來，我國羊肚菌產業發展迅猛，栽培規模擴大，助力羊肚菌產業發展已成為地方政府年度規劃和當地農民重要的經濟來源和特色產業。但羊肚菌栽培過程中連作障礙“卡脖子”問題已成為不可逾越的鴻溝，導致其產量和品質大幅下降，這一短板嚴重制約了羊肚菌產業的綠色健康、可持續發展。

作物連作障礙產生機理十分復雜，是系統內諸多因素綜合作用的結果［3］。隨著科學研究的縱向延伸，研究成果推測作物—微生物—土壤系統的平衡關系失調是引起連作障礙的主要因素［4］。連作障礙問題已成為嚴重制約農林業健康發展的首要問題。基于合理的輪作，有利于維持土壤微生物的生態平衡，助力土壤微生物活性增強，有效改善土壤質量，從而緩解連作障礙［5］。此外，研究表明，羊肚菌與番茄［6］、吊瓜［7］、辣椒和長裙竹蓀［8］等輪作，不僅提高了土地資源的利用率，還提升了羊肚菌的產量和品質，同時在一定程度上改善了羊肚菌的連作障礙。

食用菌具有腐生特性，對土壤中礦物質轉化、高分子降解及活性物質的富集均有較好的促進作用［9］。赤松茸也是一種在國內被廣泛推廣栽培的珍稀食（藥）用菌，學名大球蓋菇(Stropharia rugosoannulataFarl. ex Murrill)，又名皺環球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇、裴氏球蓋菇、大紅菇等，隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、球蓋菇科(Strophariaceae)、球蓋菇屬［Stropharia(Fr.) Quél.］［10］。其栽培技術成熟，栽培原料來源豐富，環境適應性強、抗雜菌、抗逆能力強［11］。種植赤松茸能夠改善土壤理化性質及提高微生物群落豐度［12］。研究揭示赤松茸與水稻、玉米、柑橘、草莓等［13-14］輪作，可明顯改善土壤質量，增加土壤酶活性，提高作物產量，有效緩解草莓連作障礙。

赤松茸和羊肚菌深受廣大人民群眾喜愛，其市場前景廣闊，其中羊肚菌在國內外市場上備受歡迎，近年來出口量持續走高，長期以來一直處于洛陽紙貴、供不應求的狀態。土壤微生物在生物地化循環中扮演著重要角色，推動著土壤物質轉換和能量流動［15］。近年來有關羊肚菌—赤松茸輪作方式對羊肚菌土壤微生物群落結構影響的研究鮮有報道，因此，關于赤松茸—羊肚菌輪作栽培能否緩解羊肚菌連作障礙，其輪作前后土壤微生物時空變化機制等還有待進一步研究。本研究根據羊肚菌栽培時間 (11—12月種植，種植周期約為5個月)與赤松茸栽培時間 (6月上旬栽植，種植周期4～5個月)上的延續吻合性，選取云南省大理州劍川縣六妹羊肚菌和赤松茸輪作栽培為試驗樣地，采用高通量測序平臺Illumina Novaseq分析羊肚菌—赤松茸栽培后，土壤微生物群落中細菌和真菌的變化趨勢，進而解析并探討羊肚菌—赤松茸輪作模式是否能夠緩解羊肚菌的連作障礙的科學問題，旨在為羊肚菌合理復種、緩解連作障礙提供基礎數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗信息

試驗采樣地位于云南省大理州劍川縣彌沙鄉六妹羊肚菌栽培基地 (海拔2656.3 m，99°63′61.57″E，26°34′37.20″N)。羊肚菌栽培1年后，同年6月在同一塊地上栽培赤松茸，待羊肚菌和赤松茸采收結束后，分批次進行采樣，采樣過程中土樣設置3個重復，使用50 mL康寧離心管 (已滅菌)進行分裝，確保土樣完整、無污染。取樣完成后低溫保藏，每個樣本置于-80 ℃冰箱中保存。本次采集土樣分別為羊肚菌原壤（ydj0：zcl051、zcl052、zcl053）、羊肚菌1年壤（ydj1：zcl055、zcl056、zcl057）和赤松茸1年壤（csr1：zcl088、zcl089、zcl090）。

1.2 土壤微生物高通量測序及生物信息學分析

委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illumina Novaseq平臺進行土壤樣品高通量測序。采用DNA提取試劑盒提取和純化，使用特異引物515F（5′-CCTAYGGRBGCASCAG-3′）和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）對土壤細菌16S rRNA基因的16S V4變區進行PCR擴增。擴增真菌通用引物序ITS5-1737F和ITS2-2043R(ITS5-1737F: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，ITS2-2043R: 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠回收，用Qia-gen Gel Extraction Kit (Qiagen, Ger-many) 進行純化，采用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparat-ion Kit試劑盒進行文庫構建，經過Qubit@ 2.0熒光計 (Thermo Scient-ific)和Agilent Bioanalyzer 2100系統進行評估，文庫合格后，在Illumina NovaSeq平臺上對該文庫進行測序，并生成250 bp雙末端讀數。

使用FLASH （Version 1.2.7）軟件對樣本Reads進行拼接，過濾處理，參照Qiime （Version 1.9.1）軟件進行質控處理，使用UCHIME算法檢測并去除嵌合體序列，得到最終的有效數據。將序列在97% 相似度下，利用Uparse （Version 7.0.1001）軟件對所有樣本序列進行聚類成為OTUs。用Mothur（Version 1.30.2）與SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0），統計各個分類水平各樣本的群落組成。對各樣本的數據進行均一化處理后，使用Qiime （Version 1.9.1）軟件計算α多樣性指數 （Shannon、Simpson、Chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree），使用R （Version 2.15.3）軟件繪制稀釋曲線和進行α多樣性指數組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌—赤松茸土壤細菌和真菌OTU聚類分析

稀釋性曲線 (Rarefaction Curve)旨在從樣本中隨機抽取一定數量序列，用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中物種多樣性，并間接反映樣品中物種豐富程度。由圖1可知，在各樣品所含有效序列數范圍內，隨樣品測序條數的增加，曲線趨于平緩，說明樣品序列充分，此環境中物種并不會隨測序數量的增加而顯著增多，可進行數據分析。通過統計各階段序列數、序列長度等參數對數據開展評估。本試驗共涵蓋9個土壤樣本，測序后共獲得細菌739289對原始序列 (Raw reads)，經質控、拼接后共產生671886條高質量序列 (Clean Reads)，每個樣品至少產生63726條Clean Reads，平均產生74654條Clean Reads，平均長度為253 bp。分析共獲得真菌728065對Raw Reads，雙端Reads質控、拼接后共產生658169條Clean Reads，每個樣品至少 產 生54299條Clean Reads，平 均 產 生73130條Clean Reads。

圖1 樣品稀釋曲線

對所有處理在97%序列相似度下得到的土壤細菌OTU數目進行聚類統計，繪制韋恩（Venn）圖用以直觀呈現不同處理共有特征和特有特征的數目（圖2），從而結合特征所代表物種，找出不同環境中特有微生物。所測得的細菌共有27門、60綱、170目、312科、603屬和683種，其中真菌共有23門、61綱、123目、176科、197屬和206種。由圖2可知，羊肚菌原壤、羊肚菌1年壤和赤松茸1年壤3種土樣共同擁有細菌OTU數目為1760個、真菌OTU數目為177個，3種土樣特有細菌OTU數目分別為7、28和88個，特有真菌OTU數目分別為55、51和236個，ydj0和ydj1共有111個細菌OTU、104個真菌OTU，僅有46個細菌OTU和31個真菌OTU同時分布于csr1和ydj1中，csr1與ydj0共有細菌OTU數目和真菌OTU數目分別為31和42個。

圖2 韋恩圖

2.2 羊肚菌—赤松茸土壤細菌和真菌多樣性分析

基于土壤樣品中細菌群落α多樣性分析指數，對羊肚菌、赤松茸栽培土壤細菌群落物種豐富度和均勻度進行評估 (cutoff=57363)。結果揭示：不同處理土壤的細菌和真菌多樣性指數覆蓋率分別達到99.6%以上和100.0%（表1），說明土壤樣本測序數據足夠真實，可反映其細菌和真菌群落的多樣性。由表1可知，代表土壤細菌群落豐富度的ACE指數與Chao1指數和代表多樣性的Simpson指數與Shannon指數均無顯著差異，ACE指數與Chao1指數隨著羊肚菌和赤松茸的更替栽培均呈下降趨勢，但Simpson指數分析顯示，ydj1細菌群落多樣性最低，csr1最高，而Shannon指數分析顯示ydj0、ydj1和csr1的Shannon指數差異較明顯，ydj0中土壤細菌群落內物種分布多樣性最高， csr1次之， ydj1中最低。表征真菌群落多樣性的Shannon指數和Simpson指數以及表征豐富度的Chao1指數和ACE指數均存在明顯差異。與ydj0相比較，ydj1和csr1的α多樣性各指數大都在升高，且csr1各指數大都高于ydj1，表明赤松茸栽培可提高羊肚菌土壤中細菌和真菌群落內物種的多樣性，同時通過栽培赤松茸可提高羊肚菌土壤中真菌群落內的物種豐富度。

表1 樣本真菌和細菌α多樣性指數

非度量多維尺度NMDS (Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)散射圖估算的真菌和細菌群落β多樣性顯示，群落分布分為csr1、ydj0和ydj1 3個不同的組 (圖3)，圖中點分別表示各樣品，不同顏色代表不同分組，點與點之間的距離表示差異程度，真菌和細菌的NMDS分析圖顯示兩者的stress分別為0.0180和0.0254，均小于0.2，表明NMDS分析具有一定的可靠性，且ydj0和ydj1組真菌、細菌群落相似性較高，csr1與其他2組的差異性較大。

圖3 NMDS分析

2.3 羊肚菌—赤松茸土壤細菌群落結構組成分析

過濾低豐度特征 (物種豐度＜0.005%)，獲取門水平各樣品中相對豐度較大的10個細菌門類群(圖4)。ydj0、ydj1和csr1這3組土樣中相對豐度存在差異，其中Proteobacteria和Bacteroidota隨著羊肚菌和赤松茸的栽培呈上升趨勢，且Proteobacteria為3組土壤細菌的主要優勢類群，Bacteroidota在3種土樣中相對豐度存在顯著差異；Chloroflexi和Myxococcota隨著羊肚菌—赤松茸的栽培呈下降趨勢，且csr1中Myxococcota相對豐度顯著降低；ydj1較ydj0的Acidobacteriota顯著減少，但通過栽培赤松茸后顯著增加；Actinobacteriota在羊肚菌栽培后呈現增加趨勢，但栽培赤松茸后顯著降低。而Gemmatimonadota和Verrucomicrobiota變化與Actinobacteriota趨勢相反；與對照組ydj0相比，Firmicutes呈上升趨勢，但與ydj1相比，栽培赤松茸后該細菌類群減少。研究揭示栽培赤松茸可有效調節羊肚菌栽培后土壤內細菌菌群。

圖4 門水平上3組土樣細菌分布情況

科、屬水平分析表明：在相對豐度較大的科和屬中（圖5），栽培赤松茸后土壤細菌群落Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas和Pseudomonadaceae的Pseudomonas顯著下降，Gemmatimonadaceae在ydj0、ydj1和csr1這3種土壤中為細菌優勢菌科，優勢屬細菌分別為Pseudomonas(5.93%)、Sphingomonas(6.20%)和隸屬于Gemmatimonadaceae的未知屬(6.75%)；Xanthobacteraceae (5.91%)、Nitrosomonadaceae (3.38%)和Micrococcaceae (3.59%)相對豐度在ydj1中占比最高，但經過栽培赤松茸后明顯減少；Chitinophagaceae和Comamonadaceae相對豐度隨著羊肚菌和赤松茸的輪作栽培呈上升趨勢，且Chitinophagaceae顯著增加。

圖5 科 (屬)水平上各樣本細菌分布情況

使用R軟件，選取土壤真菌菌群豐度排名前100的屬，根據其在各個土壤處理中的豐度信息，從真菌菌群種類、土壤類型2個層面進行聚類，根據聚類結果繪制成Heatmap熱圖（圖6）。通過聚類能夠區分高豐度和低豐度的分類單元，紅色和藍色代表菌屬的豐度，越偏向紅色表明豐度越高，越偏向藍色表明豐度越低。如圖6所示對不同土樣細菌在屬種水平上進行分析，根據進化關系，細菌群落OTU在縱向上可以聚類為兩大類，根據豐度變化顯示，Arenimonas、Bacteroides、Bacillus、Pseudolabrys、Nitrospira、Bryobacter、Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia、Chryseolinea、Chthoniobacter、Comamonas、Devosia、Ellin6067、mle1_7、Pandoraea和Rubrobacter等在csr1中豐度最高，且csr1中Candidatus_Solibacter和Candidatus_Udaeobacter豐度與ydj0的相近，Bradyrhizobium細菌群落豐度在csr1中顯著降低。

圖6 樣品細菌屬水平聚類熱圖

2.4 羊肚菌—赤松茸土壤真菌群落結構組成分析

原始特征表常涵蓋極低豐度特征 (物種豐度＜0.005%)，過濾低豐度特征后，旨在獲取各樣品中相對豐度較大的真菌類群，研究分析了樣本真菌群落在門和屬水平上的豐度變化情況 (圖7)。基于不同樣品中優勢真菌門的分析表明： ydj0、ydj1和csr1優勢門均為Ascomycota，Mucoromycota真菌在csr1中豐度最高，Basidiomycota在ydj0中豐度最高；ydj0和ydj1 優勢屬真菌為Tausonia，而csr1優勢屬真菌為Mucoromycota。

圖7 門 (屬)水平上各樣本真菌分布情況

使用R軟件，選取土壤真菌菌群豐度排名前100的屬，根據其在各個土壤處理中的豐度信息，從真菌菌群種類、土壤類型2個層面進行聚類，根據聚類結果繪制成Heatmap熱圖。通過聚類能夠區分高豐度和低豐度的分類單元，紅色、藍色代表菌屬的豐度，越偏向紅色表明豐度越高，越偏向藍色表明豐度越低。如圖8所示對不同土樣細菌在屬種水平上進行分析，根據進化關系，細菌群落OTU在縱向上可以聚類為兩大類，根據真菌豐度變化趨勢，ydj0和ydj1這2組樣本聚為一支，表明這2組細菌群落組成相似度較高；csr1與ydj0、ydj1這2組樣本細菌群落組成差異性較大，且差異性較大的真菌群落有Phymatotrichopsis、Sphaerode、Mortierella、Geminibasidium、Olpidium、Chaetomium、Thelebolus、Sistotrema和Spizellomyces。值得關注的是，Fusarium在ydj0組中豐度最高，在csr1組中豐度最低。

圖8 樣品真菌屬水平聚類熱圖

本試驗土樣中Basidiomycota、Fusarium和Tausonia，Hypocreales、Pleosporales和Leotiomycetes內的一些真菌類群在栽培赤松茸后出現不同程度地減少，而Chaetomium、Mortierella和unclassified_Sordariales的一些真菌屬在栽培赤松茸后出現了不同程度的增加，栽培赤松茸后土壤中Ascomycota和Mucoromycota真菌相對豐度變化趨勢與羊肚菌栽培后截然相反；其中Chaetomiaceae內真菌在羊肚菌栽培后大幅增加，但在栽培赤松茸后土壤中該類群真菌大幅度降低。

3 結論與討論

土壤細菌群落結構是土壤生態環境質量的重要組成部分，且扮演著不可替代的作用［16］；本研究土壤微生物群落結構分析表明，輪作對土壤微生物群落種類組成影響較小，但在群落相對豐度上存在顯著差異。王瑾［17］研究揭示，Chitinophagaceae與硝化作用呈正相關，Comamonadaceae參與有機碳的降解，Bacteroidetes參與有機氮的礦化；本研究 中Chitinophagaceae、Comamonadaceae和Bacteroidota的相對豐度隨著羊肚菌—赤松茸的輪作栽培呈上升趨勢，且Bacteroidota和Chitinophagaceae的相對豐度顯著增加，說明輪作赤松茸有助于增加羊肚菌土壤中的有益微生物。徐新雯等［18］研究表明，輪作大蒜可以提高煙根際有益細菌Gemmatimonadetes的數量和多樣性，而本研究中栽培羊肚菌后土壤中該類菌群減少，輪作赤松茸后該類菌群出現增加趨勢，與上述研究結果一致。殷繼忠等［16］基于分析連作對大豆根際土壤細菌菌群結構的影響表明，大豆連作后土壤中Sphingomonas的相對豐度均大于輪作土樣，本研究中Sphingomonas在ydj1的豐度占比顯著增加，通過輪作赤松茸可顯著降低該菌群的豐度，從而維持土壤細菌群落的平衡。納小凡等［19］基于研究連作對再植枸杞根際細菌群落多樣性和群落結構的影響，表明了枸杞根際連作后Verrucomicrobiota的相對豐度明顯降低；本研究中ydj1樣品中該菌群最低，輪作赤松茸后土壤中該類菌群出現增加趨勢，間接證明輪作可維持土壤中該菌群的平衡。輪作赤松茸后土壤中大多數細菌類群與栽培羊肚菌后變化趨勢相反，該結果表明輪作赤松茸能夠干擾羊肚菌與土壤微生物間的互相作用，可有效調節羊肚菌根際土壤益生菌和致病菌群間的平衡關系。

肖禮［20］研究認為，土壤微生物中大部分真菌類群參與了土壤有機質礦化的分解，促進了土壤養分的更新和再利用，并提高了土壤有效養分的含量。Phong等［21］研究表明，真菌Chaetomium類群為常見的生防菌，可有效降解纖維素和有機物，并對土壤中其他微生物產生拮抗作用；本研究數據揭示真菌Chaetomium類群在赤松茸栽培后顯著增加，可能是赤松茸土壤中大多數真菌相對豐度減少的原因之一。鐘壹鳴等［22］通過檳榔間作香露兜發現，自養型有益細菌Chloroflexi的相對豐度與全磷呈極顯著負相關，而羊肚菌栽培后土壤磷含量顯著上升［23］，本研究中栽培羊肚菌后Chloroflexi呈下降趨勢，這可能是由土壤磷含量顯著上升導致；Tan等［24］研 究 表 明，Chloroflexi的 豐 度 與 羊肚菌產量呈正相關，推測該類群微生物與羊肚菌連作障礙呈負相關。本研究數據顯示：栽培赤松茸后Mucoromycota和Sordariales有增加趨勢，而Sordariomycetes中Paecilomyces penicillatus和Diploospora longispora是阻礙羊肚菌的生產和質量以及引起羊肚菌白霉病［25］和霉菌性枯萎病［26］的主要病原菌，因此赤松茸輪作后，在羊肚菌栽培過程中需及時防范該類病害的發生。

敖金成等［27］研究表明，土壤真菌、細菌、放線菌、固氮、解磷等功能菌數量與土壤肥力高低呈正相關；徐繼偉等［23］通過研究羊肚菌栽培的經濟效益及對土壤的影響，發現羊肚菌栽培前后棚內外土壤磷含量顯著上升，而微球菌Micrococcaceae為解磷作用的微生物［28］，本研究中Micrococcaceae相對豐度在ydj1中占比最高，推測該類菌群與羊肚菌栽培后磷元素含量的上升有直接關系。土壤結構的良好維持和物質養分的轉化，離不開土壤中較高的微生物群落多樣性［29］，Tan等［30］研究揭示，羊肚菌產量與土壤真菌和細菌群落多樣性呈正相關，且在羊肚菌高產量土壤中發現了一些參與固氮和硝化的細菌微生物，如Arthrobacter、Bradyhizobium、Devosia、Pseudarthrobacter、Pseudolabrys、Nitrospira和Candidatus_Solibacter等［31］；Fan等［32］研究證實，Candidatus_Solibacter和Brad-yrhizobium的生物多樣性決定了作物的產量，與作物產量呈正相關，并與大部分參與養分循環的功能基因豐度呈正相關。本試驗中栽培赤松茸后Candidatus_Solibacter、Devosia、Pseudolabrys等微生物顯著增加，且表征微生物群落多樣性的Shannon指數和Simpson指數在csr1組中均高于ydj1組；該結果表明：輪作赤松茸有利于提高土壤肥力的同時也有助于羊肚菌產量的提高。

研究發現菇—菜—辣椒［33］和西瓜—草菇—辣椒［34］輪作能明顯改善土壤根際環境，提高土壤有機質的含量，增加土壤中細菌的數量，降低有害病原真菌的數量，恢復土壤微生物種群數量，對辣椒連作障礙有明顯緩解作用。本研究采用高通量測序技術從土壤微生態菌群變化視角進行分析，結果表明：輪作赤松茸可提高羊肚菌土壤中微生物群落物種多樣性，有助于增加土壤有益細菌類群和降低病原真菌類群，同時在一定程度上能夠有效調節羊肚菌土壤微生物菌群結構的平衡關系，與上述研究結果一致，這為進一步解析羊肚菌連作障礙“卡脖子”問題提供了微生物學視角的基礎數據支持。但該研究僅從細菌、真菌群落組成及相對豐度的角度分析了羊肚菌—赤松茸輪作土壤微生物群落結構和多樣性，這些微生物豐度變化所導致的生態功能不同及對羊肚菌和赤松茸產量的影響仍需從不同角度進行深入剖析。