甜櫻桃種子快速萌芽及組培成苗技術(shù)研究

董 軍，洪 莉，陳令會，阮夢雅

（臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺州 317000）

甜櫻桃(Prunus aviumL.)屬于薔薇科(Rosaceae)落葉果樹，是一種重要的經(jīng)濟水果，營養(yǎng)保健價值較高，素來享有“果中珍品”和“春果第一枝”的美譽，深受消費者的喜愛，目前浙江等南方地區(qū)已成為甜櫻桃種植的熱門選地之一［1-2］；但是由于浙江等地夏季高溫高濕、冬季需冷量不足會嚴重制約甜櫻桃品種的選育工作，甜櫻桃對生長環(huán)境有著極其嚴格的要求，常規(guī)育種方式速度較慢，可采用組織培養(yǎng)技術(shù)有效解決［3-4］。

常規(guī)櫻桃實生苗的培育一般采用冬季沙藏的方法進行繁殖，也可通過4 ℃冰箱冷藏處理打破休眠，一般情況下每年5—6月成熟采收甜櫻桃種子必須經(jīng)過90～100 d低溫層積才能打破種子休眠，保證種子出苗［3-5］。近年來，為保證種子的正常萌發(fā)，科研人員大多利用赤霉素(GA)等植物激素處理的方式來促進種子萌發(fā)，并且可在當年獲得第一代種苗，但是其中所用的激素種類、濃度及培養(yǎng)條件相差較大［6-9］。胚培養(yǎng)是人們利用植物體胚具有細胞全能性的特點來進行人工離體培養(yǎng)的一種繁殖技術(shù)，胚培養(yǎng)能夠提高成苗率，縮短育種周期，進一步加快育種進程［10］。胚培養(yǎng)在早熟葡萄胚搶救中的應(yīng)用較為成熟［11］，在早熟的李子和杏子的幼胚培養(yǎng)中也有一定應(yīng)用［12］。

洪莉等［13］在甜櫻桃種子快速萌芽育苗試驗研究過程中發(fā)現(xiàn)赤霉素(GA)對打破種子休眠、萌芽有較好的促進效果，其效果遠大于6-芐氨基阿腺嘌呤(6-BA)等植物激素。故本試驗以甜櫻桃種子為試材，將傳統(tǒng)的低溫層積、赤霉素處理等技術(shù)與胚培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，篩選出促進甜櫻桃種子快速萌發(fā)及生長的最佳條件，建立一套穩(wěn)定、高效的萌芽培養(yǎng)體系，旨在借助于現(xiàn)代生物育種技術(shù)提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的早羅賓、布魯克斯、紅蜜等甜櫻桃種子，取其種子為外植體，取材時間為2022年5月。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌芽處理 開始選擇轉(zhuǎn)色期至成熟期的甜櫻桃果實，去除果肉，選取顆粒飽滿圓潤的甜櫻桃種子，用錘子敲掉外殼，放入滅菌的三角瓶內(nèi)，再加入幾滴1%的聚山梨酯-80溶液，然后用0.1%的氯化汞溶液浸沒種子消毒，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，接種過程中保證種子橫置半埋于培養(yǎng)基中。設(shè)置GA濃度分別為0、50、100、200、400 mg/L，6-BA濃度為2 mg/L，生長素（IBA）濃度為1 mg/L，分別置于4 ℃透明冰箱（處理T1～T5）和24 ℃恒溫培養(yǎng)室（處理T6～T10）中進行培養(yǎng)，每種處理10瓶，每瓶接種種子3～5個，處理3周后統(tǒng)計種子污染率、萌芽率、生長情況等。

參照上述種子處理方法將去除果肉后的甜櫻桃種子置于室內(nèi)陰干，然后放入紗網(wǎng)袋內(nèi)，于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。儲?周后進行種子萌芽率的比較，然后經(jīng)處理后3周調(diào)查萌芽率、生長狀況等。

1.2.2 種苗增殖培養(yǎng) 首先將萌芽的種苗接種到不含激素的增殖培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)1～2次，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值為5.6。然后選取生長一致、健壯良好的種苗接種到含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中，設(shè)置增殖培養(yǎng)基T11～T15共5種處理方式，每個處理中生長素（IBA）、萘乙酸(NAA)的濃度均為0.1 mg/L，6-BA濃度分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L。每 種 處 理 接 種 約10瓶，每瓶接種3～5株，并進行統(tǒng)計記錄種苗的增殖系數(shù)、生長狀況等。

1.2.3 種苗生根培養(yǎng) 將繼代苗轉(zhuǎn)接到不含激素的空白培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2代，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，隨后選取生長一致、健壯，株高1.5～3.0 cm的種苗接種到生根培養(yǎng)基，試驗設(shè)置生根培養(yǎng)基種類T16～T20共5種處理方式，生長素IBA的濃度分別為0、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L，每個處理中萘乙酸(NAA)的濃度均為0.1 mg/L。每種處理方式接種10瓶，每瓶接種3～5株，將接種的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，并統(tǒng)計瓶苗的生根長度、生根率以及生長狀況等（表4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素及溫度處理對種子萌芽率的影響

由表1可知，溫度和GA激素濃度對櫻桃種子萌發(fā)有較大影響。3周后，4 ℃條件下GA濃度為100 mg/L（T3）時種子萌芽率最高，達到73.33%；然后隨著GA濃度的增加，甜櫻桃種子的萌發(fā)率開始下降。3周后，24 ℃條件下，GA濃度為400 mg/L（T10）時的種子萌芽率達到最高（68.67%）；增加GA濃度對甜櫻桃種子萌芽產(chǎn)生較大影響，在一定范圍內(nèi)提高GA濃度可以明顯提高種子萌芽率。T1和T6表明，在低溫或室溫條件下，僅添加6-BA、IBA處理對于甜櫻桃種子萌芽效果較差，添加合適范圍濃度的GA可以促進甜櫻桃種子快速萌芽。隨后通過4～5周的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下，5周時T3、T4的櫻桃種子萌芽率超過90%，T5的種子萌芽率開始下降，說明GA濃度超過200 mg/L后對櫻桃種子的萌芽率無促進作用，甚至?xí)种破浒l(fā)芽；24 ℃條件下，各處理的甜櫻桃種子萌芽率普遍不高，提高幅度較小，萌芽率基本穩(wěn)定在50%～70%，不同濃度的GA對種子萌芽率的促進作用不顯著。4 ℃條件下的萌芽不存在子葉增生、易污染等問題，綜合考慮，采用4 ℃+100 mg/L GA為最佳處理，可以促進甜櫻桃種子快速萌芽，并且萌芽率最高可超過90%。

表1 不同濃度激素及溫度處理對種子萌芽的影響

2.2 激素處理對儲藏過久甜櫻桃種子萌芽率的影響

由表2可知，適當濃度的激素處理可以提高儲藏時間過久的甜櫻桃種子萌芽率，4 ℃冰箱儲存5周后，甜櫻桃種子萌芽率呈現(xiàn)較低水平，品種間萌芽率同樣存在差異，布魯克斯的種子萌芽率整體高于紅蜜的。隨著GA濃度的提高，甜櫻桃種子萌芽率不斷提高，當GA濃度為400 mg/L時，紅蜜和布魯克斯的種子萌芽率均達到最高，分別為7.12%和9.49%；但紅蜜、布魯克斯的種子萌芽率均不超過10.00%，大部分處理的種子都未出現(xiàn)明顯萌動，少部分種皮破裂，還需要一段時間后種子才能正常萌發(fā)。綜上所述，儲藏時間太長會對甜櫻桃種子萌芽率產(chǎn)生負面的影響，萌芽率普遍整體偏低；去除果肉后及時用適當濃度的激素處理，可以有效提高甜櫻桃種子的萌芽率。

表2 激素處理對儲藏時間過久甜櫻桃種子萌芽率的影響

2.3 不同增殖培養(yǎng)基對甜櫻桃種苗生長的影響

由表3可知，在一定濃度范圍內(nèi)提高6-BA濃度可以有效進行增殖培養(yǎng)。種苗在T23～T25的培養(yǎng)基里增殖系數(shù)都超過2.00，其中T24的種苗增殖系數(shù)最高，達3.20，且該培養(yǎng)基內(nèi)的種苗生長較快旺盛，葉片嫩綠；但當6-BA濃度超過0.75 mg/L，櫻桃種苗的增殖開始受到抑制，增值系數(shù)下降，導(dǎo)致種苗生長不良，出現(xiàn)葉片皺縮，葉片脆硬甚至玻璃化的現(xiàn)象。綜合考慮，采用T24培養(yǎng)基，即MS+0.75 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為甜櫻桃種苗生長的最佳增殖培養(yǎng)基。

表3 不同增殖培養(yǎng)基對甜櫻桃種苗生長的影響

2.4 不同生根培養(yǎng)基對甜櫻桃種苗生根的影響

由表4可知，在一定范圍內(nèi)隨著IBA濃度增加，甜櫻桃種苗生根率逐漸增大，根數(shù)增多，根長增大。T29的甜櫻桃種苗生根率達到最高，為75.0%，根數(shù)也較多，且該培養(yǎng)基內(nèi)的種苗生根速度快，一般14 d左右有根長出，根系生長狀況良好，粗細適中，須根較多；T26培養(yǎng)基中甜櫻桃種苗的生根率最低，長根速度慢甚至是不長根的情況。由此可見，適當濃度的IBA處理可以促進甜櫻桃種苗的生根，當IBA濃度為0.9 mg/L時，其種苗的生根系數(shù)達到最高，生長態(tài)勢最好，綜合考慮，采用T29培養(yǎng)基，即1/2MS+0.9 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA為最佳培養(yǎng)濃度。

表4 不同生根培養(yǎng)基對甜櫻桃種苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

甜櫻桃胚培養(yǎng)是解決甜櫻桃胚萌芽率低的有效途徑，通過胚培養(yǎng)可以獲得大量的種苗來進行嫁接擴繁，比常規(guī)育種縮短1～2年的周期，胚培養(yǎng)作為一種育種手段可有效提高育種效率。

胚萌發(fā)是胚培養(yǎng)技術(shù)的第一步，胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件因材料而異。本試驗表明，GA對甜櫻桃種子萌芽具有促進作用，GA與6-BA、IBA配合使用可以有效打破種子休眠、促進種子萌芽，其效果相較于單獨使用6-BA、IBA更加顯著；在4 ℃條件下，濃度為100 mg/L GA處理3周后的種子萌芽率達到73.33%，5周后的萌芽率可以超過90%。張琛等［14-17］用6-BA等激素進行處理同樣獲得了很高的種子萌芽率，與本試驗的研究結(jié)果不一致；本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)GA促進甜櫻桃種子萌芽的效果更好，6-BA打破種子休眠、促進萌芽的效果一般。趙艷華等［15］研究認為無論在低溫還是常溫條件下均可以促進甜櫻桃的胚萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)常溫條件可以促進已萌芽的種子正常生長，但是高濃度的GA會導(dǎo)致甜櫻桃種子出現(xiàn)子葉過快裂開、子葉加厚增生等問題，不利于種子萌芽后的生長，需及時將種苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中。本研究還發(fā)現(xiàn)甜櫻桃種子儲存時間過長會對種子萌芽率產(chǎn)生不利影響，去除果肉后及時做保濕處理是保證甜櫻桃種子正常萌芽的首要條件。綜上認為，甜櫻桃種子采收后及時采用適宜濃度GA處理，輔以低溫條件，可有效促進甜櫻桃種子快速萌芽。

鄭瑋［18］研究認為不同基因型甜櫻桃莖尖培養(yǎng)成活率差異較大，這與本文的不同品種的甜櫻桃種子在相同增殖培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)存在差異的研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度6-BA(≥1.0 mg/L)會導(dǎo)致植株出現(xiàn)葉片皺縮卷曲、葉片脆硬等現(xiàn)象；同樣6-BA濃度（≤0.5 mg/L）過小會導(dǎo)致植株存在生長緩慢、增殖不足等問題。與秦志華等［16-17］研究認為的高濃度6-BA對甜櫻桃的增殖效果不利，甚至?xí)?dǎo)致植株玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)MS+0.75 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA配置最佳，該處理的增殖效果較好，增殖系數(shù)達3.2，種苗健壯、生長旺盛。一定范圍內(nèi)隨著IBA濃度的增加生根率逐漸提高。本研究生根培養(yǎng)基以1/2MS+0.9 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA配 置 為 最佳，生根率達75.0%。一定范圍內(nèi)提高IBA濃度對于提高生根率有明顯的促進作用；低濃度的IBA需要延長生根培養(yǎng)時間才能保證正常的生根率，過長的培養(yǎng)時間會導(dǎo)致種苗營養(yǎng)不足，長勢減弱，不利于后期煉苗移栽。

傳統(tǒng)方法認為甜櫻桃等核果類種子需要一定時間的低溫來打破休眠才能保證其萌芽率，本試驗通過“低溫+激素”處理來解決了種子休眠和萌芽率低的問題，通過組織培養(yǎng)的方式對種苗進行組織擴增，提高了育種效率，對于縮短甜櫻桃新品種選育周期具有一定參考借鑒作用。