以鉑類為基礎(chǔ)治療非小細(xì)胞肺癌的療效及與MTHFR C677T基因多態(tài)性的相關(guān)性分析

靳桂紅 王道軍 馬 朝

肺癌是我國高死亡率的惡性腫瘤，可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC約占所有肺癌的80%[1-2]。由于NSCLC早期發(fā)病癥狀并不具備特異性，確診時多已處于中晚期，以鉑類為基礎(chǔ)治療的方法仍是NSCLC患者的主要選擇的，但此類化療方案在不同NCSLC患者中療效差異較大[3-4]，有研究發(fā)現(xiàn)[5]，療效差異與基因多態(tài)性存在密切關(guān)聯(lián)。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTFHR)是一碳代謝途徑的限速酶，在DNA的復(fù)制和修復(fù)中發(fā)揮作用。目前有報道發(fā)現(xiàn)[6]，不同的突變類型會導(dǎo)致MTFHR酶活性存在差異性，進(jìn)而影響臨床療效。而C677T位點突變是MTFHR最常見的突變類型，多項研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性[7-8]。因此本研究主要探討以鉑類為基礎(chǔ)治療的NSCLC的療效及其與MTHFR C677T基因多態(tài)性的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象及臨床資料

選取2013年4月～2018年7月我院經(jīng)病理確診且行手術(shù)切除的NSCLC患者180例為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①東部腫瘤協(xié)作組(eastern cooperative oncology group，ECOG)標(biāo)準(zhǔn)評分0～2分；②病理分期為Ⅱ或Ⅲ期；③化療前血常規(guī)、肝腎功能、心功能未見明顯異常；④手術(shù)切除術(shù)后接受鉑類藥物為基礎(chǔ)的輔助化療；⑤預(yù)計生存周期>3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后未接受鉑類藥物為基礎(chǔ)的輔助化療；②小細(xì)胞肺癌者；③不能完成隨訪者；④術(shù)后接受輔助放療者；⑤合并其他惡性腫瘤者。所有患者于術(shù)前或化療前采集靜脈血樣本，置于抗凝管中，-80 ℃保存待測。另選擇同期于我院進(jìn)行體檢的健康人100名作為健康對照組，兩組年齡、性別等資料比較，差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 化療方案

術(shù)后4～6個周根據(jù)研究組患者手術(shù)恢復(fù)情況予以第1d順鉑75 mg/m2，聯(lián)合培美曲塞500 mg/m2(非鱗癌)或長春瑞濱25～30 mg/m2第1 d和第8 d。21 d為1個周期，共進(jìn)行≥4個周期的治療。

1.3 DNA提取及基因檢測

DNA提取：采集EDTA抗凝血250 μl轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，10000 rpm/min離心1 min，吸去上清后，加入250 μl Elution Buffer，顛倒數(shù)次混勻后再加入20 μg蛋白酶K(20 mg/ml)溶液，加入200 μl Buffer BL，立即渦旋振蕩充分混勻。將以上混合物加入一條吸附柱AC中，將樣品液放入DNA Mini Column中，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液，加入500 μl Buffer KB，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液；再加入 600 μl Wash Buffer，以12000 rpm/min離心30 s，棄去廢液；將吸附柱AC放回收集管中，以12000 rpm/min離心2 min，盡量去除漂洗液；取出吸附柱AC，放入1.5 ml離心管，加入120 μl洗脫緩沖液Elution Buffer，水浴箱(65 ℃)5 min，以12000 rpm/min離心1 min。收集DNA溶液，置于-80 ℃保存。基因檢測：采用Axygene全血基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA，采用直接測序法測定MTHFR C677T基因多態(tài)性，引物序列上游：5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游：5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'。交由上海生工生物工程有限公司合成后，待反應(yīng)完成后送往公司進(jìn)行測序。

1.4 隨訪及預(yù)后判定

研究組所有患者均在以鉑類為基礎(chǔ)的化療治療開始后進(jìn)行隨訪，隨訪方式為電話隨訪或復(fù)診時，頻率為每3個月1次，以患者發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或全因死亡作為隨訪終點，截止日期與2020年11月30日。總生存期(OS)計算：患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或全因死亡或末次隨訪時間與初次隨訪時間時間差。無復(fù)發(fā)生存期(RFS)：定義為從開始接受手術(shù)切除治療的時間到患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或者任何原因引起的死亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T基因型分布頻率

將納入研究的180例NSCLC患者進(jìn)行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P>0.05)。研究組MTHFR C677TCC基因型頻率高于對照組(P<0.05)，CT、TT基因型在兩組間的分布頻率無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 MTHFR C677T基因型分布頻率(例，%)

2.2 MTHFR C677T基因型等位基因頻率

研究組C等位基因頻率明顯高于對照組，T等位基因頻率低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 MTHFR C677T基因型等位基因頻率(例，%)

2.3 MTHFR C677T不同基因型NSCLC患者預(yù)后比較

截止隨訪時間，180例研究組患者共有9例失訪(CC型3例，CT型2例，TT型4例)。所有患者隨訪時間12～59個月，平均38個月。所有患者中位生存期為31個月，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存時間分別為20個月、25個月、30個月，差異存在顯著性(P<0.05)。

2.4 術(shù)后接受鉑類藥物為基礎(chǔ)輔助化療的NSCLC患者OS的影響因素

在校正影響OS單因素分析結(jié)果中的年齡、性別、ECOG評分、組織學(xué)類型后，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立影響因素(HR=1.07，P=0.012)，見表3。

表3 術(shù)后接受鉑類藥物為基礎(chǔ)輔助化療的NSCLC患者總生存期的影響因素

3 討論

NSCLC患者常采用肺癌根治術(shù)聯(lián)合化學(xué)藥物進(jìn)行治療，對降低NSCLC復(fù)發(fā)率、延長患者生存時間具有顯著效果[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案主要用機(jī)制是通過破壞細(xì)胞復(fù)制所必需且關(guān)鍵的葉酸依賴性代謝過程，從而抑制細(xì)胞復(fù)制，發(fā)揮抗腫瘤作用，但會因個體差異產(chǎn)生不同的治療效果，因此探討個體基因組差異與藥物敏感性的關(guān)系，進(jìn)而制定個性化的治療方案，對提高治療效果、延長生存期具有重要意義。

MTHFR是一碳代謝途徑的限速酶，主要參與葉酸的代謝和DNA的合成，同時在DNA的復(fù)制和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[13-14]，能不可逆地催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為 5-甲基四氫葉酸，因此MTHFR活性與葉酸代謝具有密切關(guān)聯(lián)，進(jìn)而影響NSCLC患者以鉑類為基礎(chǔ)的化療療效[15-16]。多項研究發(fā)現(xiàn)的近20個MTHFR基因突變位點中，C677T是研究較多的位點之一[17-18]。本研究結(jié)果中，180例NSCLC患者進(jìn)行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，入組病例具有一定的人群代表性，與既往文獻(xiàn)報道相近[19-20]。

既往研究發(fā)現(xiàn)[21-22]，乳腺癌患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性中的TT型化療有效率明顯高于CC型，同時在CAF方案化療組患者中MTHFR 基因 C677T 的 TT 型、CT 型患者的化療有效率均明顯高于CC型患者，可見MTHFR C677T基因多態(tài)性對指導(dǎo)乳腺癌患者個體化治療具有重要價值。Pastorelli等[23]發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因CC型患者較 TT型患者擁有更好的近期療效。而但 Tiseo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 基因 TT 型患者擁有更長的總生存期。國內(nèi)一項關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性與以培美曲塞為基礎(chǔ)治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效相關(guān)性的META分析中發(fā)現(xiàn)[25]，MTHFR C677T基因CC型的晚期NSCLC患者采用培美曲塞為基礎(chǔ)化療的客觀緩解率較其他基因型更高。本研究結(jié)果中，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存時間分別為20個月、25個月、30個月，CC型中位生存時間明顯低于CT/TT型，與Smit等[26]報道一致。同時本研究通過采用COX風(fēng)險比例模型分析OS的獨立影響因素，結(jié)果顯示：在校正影響OS單因素分析結(jié)果中的年齡、性別、ECOG評分、組織學(xué)類型后，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立影響因素，提示MTHFR C677T基因型CC是OS的獨立危險因素，分析原因可能是此類突變的基因型MTHFR活性提高，造成葉酸代謝水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致以鉑類藥物的作用靶點增加，有助于提高療效[27-28]。但考慮到本次研究均為亞洲人種，樣本量較少，結(jié)果有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，MTHFR C677T基因型與以鉑類為基礎(chǔ)治療的NSCLC療效存在相關(guān)性，基因型CC是影響患者OS的獨立危險因素，對接受以鉑類為基礎(chǔ)治療的NSCLC患者的預(yù)后具有一定的臨床指導(dǎo)意義。