山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)

楊 倩，李 婷，鮮思美

1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2. 貴州省動物疫病研究所，貴州貴陽 550025

白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2， IL-2），主要由Th1型淋巴細(xì)胞分泌，能促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖及維持其活性[1]，在IL-2的作用下抗原提呈顯著增強，它對其它細(xì)胞因子的分泌也有一定的促進(jìn)作用，是促進(jìn)機體產(chǎn)生免疫的一類重要細(xì)胞因子[2]。通過持續(xù)注射一定劑量IL-2，對T細(xì)胞分化成熟有一定效果，并能增加外周血中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，增強機體免疫應(yīng)答能力。所以，可以把IL-2與亞單位疫苗或核酸疫苗等聯(lián)用，以作為細(xì)胞因子免疫佐劑，增強免疫效果。目前，人源或不同動物來源的IL-2作為細(xì)胞因子佐劑已在多種疫病核酸疫苗研究中得到應(yīng)用[3]。本研究欲構(gòu)建貴州黑山羊IL-2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，為將pVAX1-IL-2作為核酸疫苗免疫佐劑研究提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MDBK細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、陽性質(zhì)粒pMD19-T-IL-2和pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒均由本實驗室保存。HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；IL-2基因ELISA檢測試劑盒購自武漢基因美公司；Lipofatamiane 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genbank登錄的山羊IL-2基因序列（NM_001287567），利用軟件設(shè)計一對引物，IL-F：5'-CCCAAGCTTACCACCATGTACAAGCTACAACTCTTG TC-3'，IL-R：5'-CGGAATTCTCAAGTCATTGTTGACTAG ATG-3'，預(yù)擴增片段大小為468 bp，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 山羊IL-2基因擴增

以pMD19-T-IL-2克隆質(zhì)粒為DNA模板進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將質(zhì)粒pMD19-T-IL-2及載體質(zhì)粒pVAX-1經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切并進(jìn)行膠回收，回收純化后的IL-2基因與pVAX1載體利用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化成功的單菌落質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，同時送往上海英濰捷基公司測序?！?br>