干擾山羊KLF12促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞分化

杜宇，王永，孟慶勇，朱江江，林亞秋

干擾山羊促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞分化

1西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

脂肪組織分為皮膚下的皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue，SAT）和腹部?jī)?nèi)器官周圍的內(nèi)臟脂肪組織（visceral adipose tissue，VAT），皮下脂肪作為影響肉類美味與否的重要因素，探究皮下脂肪沉積分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于育種改良和畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。Krüppel-like factors12 ()是一個(gè)進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，可以在多種細(xì)胞類型中表達(dá)并控制著廣泛的細(xì)胞過(guò)程。【】研究獲得山羊的分子特征并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)明確在山羊組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式以及干擾對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究在脂肪沉積過(guò)程中的潛在作用提供理論依據(jù)。利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）方法克隆山羊完整編碼序列（coding sequence，CDS）區(qū)，使用在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)山羊核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)在山羊心臟、肝臟、腹部脂肪、皮下脂肪、臂三頭肌、背最長(zhǎng)肌等14個(gè)組織中的表達(dá)水平，以及誘導(dǎo)分化不同時(shí)間段在皮下前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。隨后，試驗(yàn)通過(guò)化學(xué)合成山羊小干擾RNA（si-），使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將山羊si-序列轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中。使用100 μmol·L-1油酸導(dǎo)液誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。利用油紅O以及Bodipy染色方法和qRT-PCR技術(shù)分別從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)的角度闡明干擾對(duì)皮下前體脂肪細(xì)胞脂滴積聚和脂肪分化標(biāo)志基因mRNA表達(dá)水平的影響。試驗(yàn)成功獲得包含開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）（1 209 bp）的山羊（1 315 bp，編碼402個(gè)氨基酸）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示KLF12主要位于細(xì)胞核，此外，KLF12無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，且在317—341、347—371及377—399氨基酸處存在3個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF_C2H2）。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示在山羊心臟和脾臟的表達(dá)水平極顯著高于其他組織（＜0.01）。此外，在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化60 h時(shí)達(dá)到峰值。于山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-后利用油紅O以及Bodipy染色法從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞脂滴聚積明顯增加，同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示，脂肪分化標(biāo)志基因脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，）的表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）而前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)因子（preadipocyte factor 1，）的表達(dá)水平極顯著降低（＜0.01）。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果以及脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)水平變化情況，推測(cè)在皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起到負(fù)調(diào)控作用。通過(guò)對(duì)山羊的分子生物學(xué)特征、組織細(xì)胞間的表達(dá)規(guī)律以及對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的潛在調(diào)控作用的研究表明，是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的負(fù)調(diào)控因子，并且這種作用可能是通過(guò)調(diào)控、和實(shí)現(xiàn)的，為進(jìn)一步探究在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

山羊；；分子特征；干擾；皮下脂肪細(xì)胞

0 引言

【研究意義】脂肪組織分為皮膚下的皮下脂肪組織和腹部?jī)?nèi)器官周圍的內(nèi)臟脂肪組織[1-2]。研究表明，皮下脂肪與調(diào)節(jié)胰島素敏感性[3]，保護(hù)葡萄糖耐量[4]和糖尿病[5]等密切相關(guān)。此外，皮下脂肪與肌肉和肌內(nèi)脂肪一樣，也是決定肉類美味與否的重要因素之一[6]。羊肉因其味道鮮美，口感獨(dú)特從而越來(lái)越受廣大消費(fèi)者的青睞。因此，研究皮下脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于育種改良和畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】Krüppel-like factors（）是一個(gè)進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子簇，其C端區(qū)域包含3個(gè)可以與靶基因結(jié)合的Cys2-His2鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)有研究證實(shí)KLFs在多種細(xì)胞類型中表達(dá)并控制著廣泛的細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和胚胎的發(fā)育等[7–9]。近年來(lái)，已經(jīng)確定哺乳動(dòng)物KLFs家族的成員是調(diào)控前脂肪細(xì)胞形成、脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成和肥胖的關(guān)鍵參與者[10-12]。例如，Banerjee等[13]研究發(fā)現(xiàn)在3T3-L1脂肪細(xì)胞中高度表達(dá)，并通過(guò)有效抑制脂肪生成標(biāo)志基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPARγ）的表達(dá)起到抑制脂肪細(xì)胞分化和脂肪生成的調(diào)控作用。郭紅芳[14]研究表明，干擾和的表達(dá)均可抑制牛脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累。此外，牛脂肪細(xì)胞中可以促進(jìn)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，即對(duì)存在正向調(diào)節(jié)作用。是家族成員之一，最早被確定為激活蛋白2α（AP-2α）的阻遏物[15]。近年來(lái)關(guān)于的研究多集中于對(duì)卵巢癌[16]、胰腺癌[17]、胃癌[18]以及子宮內(nèi)膜蛻化[19]等疾病的調(diào)控研究，而關(guān)于在調(diào)控脂代謝和脂肪沉積的相關(guān)報(bào)道較少。現(xiàn)有研究如Mei等[20]通過(guò)GWAS途徑分析表明與糖尿病性狀有顯著關(guān)聯(lián)。Shen等[21]研究指出tRNA衍生片段（tRF）在肥胖大鼠中可以直接靶標(biāo)并促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖而抑制前脂肪細(xì)胞的分化。以上研究提示可能與脂代謝和脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)前期利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化前后的差異表達(dá)基因，推測(cè)其具有調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的作用，所以明確山羊的分子特征、組織細(xì)胞表達(dá)模式以及在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)最終揭示的基因功能尤為重要。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬克隆山羊序列并在此基礎(chǔ)上利用在線軟件對(duì)山羊進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)該基因在山羊各組織和皮下前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式。使用油紅O染色和RNA干擾等方法從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)角度檢測(cè)抑制的表達(dá)對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化的影響。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)干擾后脂肪標(biāo)志基因的表達(dá)情況，從而推測(cè)其在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的潛在作用機(jī)制。為進(jìn)一步研究在脂肪沉積過(guò)程中的潛在作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

I-5TM2×High-Fidelity Master Mix酶、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、TRIzol和pMDTM19-T Vector Cloning載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（中國(guó)）；膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司（中國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和熒光染料Bodipy購(gòu)自Thermo（美國(guó)）；血清購(gòu)自Gemini（美國(guó)）；青鏈霉素、DME/F12培養(yǎng)基和0.25%胰酶購(gòu)自Hyclone（美國(guó)）；油酸購(gòu)于Sigma（美國(guó)），轉(zhuǎn)染試劑RNAi MAX Reagent購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品采集 試驗(yàn)所用組織樣品在2018年12月于四川省簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司完成采樣。試驗(yàn)選用1周歲（公羊）健康大耳山羊（Jianzhou goat）（n=4），清晨空腹屠宰放血后立即取其各個(gè)內(nèi)臟和肌肉等組織，用已滅菌的DEPC水處理組織后用錫箔紙包裹組織樣品后置于凍存管中迅速放置液氮中儲(chǔ)存。

1.2.2 山羊CDS序列克隆 以山羊脾臟cDNA為模板，根據(jù)GenBank中山羊預(yù)測(cè)序列（登錄號(hào)：XM_005687692.3），利用Primer 5.0設(shè)計(jì)克隆引物（表1）。RT-PCR反應(yīng)體系：I-5TM2×High- Fidelity Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性98℃ 2 min；變性98℃ 10 s；退火58℃ 15 s；延伸72℃ 15 s；延伸72℃ 5 min；設(shè)定35個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，利用膠回收試劑盒收獲預(yù)期片段，連接到pMDTM19-T Vector Cloning載體后轉(zhuǎn)化于TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10—12 h后挑取單菌落于干凈的EP管中，加入含AMP的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4—6 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將符合預(yù)期片段的菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物信息

S.正義鏈引物；A.反義鏈引物；.廣泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子基因（Ubiquitously-expressed transcript gene）

S. Sense primer；A. Antisense primer；Ubiquitously-expressed transcript gene

1.2.3 山羊生物信息學(xué)分析 利用NCBI對(duì)獲得的序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，并翻譯為氨基酸序列；利用NCBI中CD-search工具以及SMART在線軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析。利用PSORT Ⅱ進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用NPSA預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，SignalIP4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽；使用Swiss-model預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用STRING進(jìn)行蛋白構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；使用MEGA 7.0軟件中鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 構(gòu)建山羊組織表達(dá)譜 根據(jù)克隆獲得的山羊CDS區(qū)序列基因設(shè)計(jì)特異的qRT-PCR引物（表1），利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在山羊13種組織中的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL、組織cDNA 1 μL、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL、ddH2O 7 μL。qRT-PCR運(yùn)行程序：預(yù)變性：95℃ 3 min，變性：95℃ 10 s，退火（：61℃，：60℃）10 s，延伸72℃ 15 s，38個(gè)循環(huán)。

1.2.5 山羊siRNA化學(xué)合成 根據(jù)克隆獲得的山羊序列（KX247669.1）設(shè)計(jì)特異性siRNA，交由Invitrogen公司合成凍干粉，使用前12 000 r/min離心10 min后按照說(shuō)明書加入1 mL RNase Free H2O溶解為終濃度20 μmol·L-1的溶液，于- 20℃保存。siRNA序列如下：siRNA 1: 5′-CAAACUGAGCCAG UGGACUUGUCCA-3′；siRNA 2: 5′-UGGACAAGUC CACUGGCUCAGUUUG-3′。陰性對(duì)照（Negative Control，NC）由Invitrogen公司提供。

1.2.6 山羊皮下前體脂肪的培養(yǎng)與si-RNA轉(zhuǎn)染 37℃水浴鍋復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的山羊皮下前體脂肪細(xì)胞，使用含10% FBS和0.1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基，F(xiàn)1代細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，F(xiàn)3代細(xì)胞接種于12孔板中，于37℃含5% CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待F3代細(xì)胞鋪板至80%時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)分化并分別于誘導(dǎo)0、12、24、48、60和96 h后加TRIzol收細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。同時(shí)，F(xiàn)3代細(xì)鋪板只80%左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染（每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），轉(zhuǎn)染前4 h更換無(wú)血清培養(yǎng)基Opti饑餓細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換100 μmol·L-1油酸導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化48 h后收集細(xì)胞用于提取RNA。

1.2.7 油紅O及Bodipy染色 用于染色的細(xì)胞接種于24孔板，處理方式同1.2.6。細(xì)胞用PBS緩沖液緩慢清洗2次，用10%甲醛固定細(xì)胞30 min，再用PBS緩沖液清洗2次之后加入油紅O工作液染色30 min。用于Bodipy染色的細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及固定方法同上，PBS緩沖液清洗2次之后加入Bodipy染色工作液，避光染色15 min。染色結(jié)束后棄去油紅/Bodipy工作液用并用PBS清洗數(shù)次直至顯微鏡下觀察清晰，拍照記錄結(jié)果。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。染色后的細(xì)胞按照每孔 1 mL 用量加入異丙醇以溶解細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的脂滴，混勻后等量加至 96 孔板中于 490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD 值。每組設(shè)置 5 個(gè)重復(fù)。

1.2.8 qRT-PCR檢測(cè) TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，qRT-PCR檢測(cè)si-轉(zhuǎn)染效率以及脂肪分化標(biāo)志基因的表達(dá)變化。脂肪標(biāo)志基因和si-引物信息見(jiàn)表2。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 qRT-PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法分析，利用SPSS 18軟件單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析。利用GraphPad Prism 5軟件繪圖，數(shù)據(jù)表示為≧4個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤即“Mean±SEM”。試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)性檢驗(yàn)。*：＜0.05；**：＜0.01。

表2 引物信息

S.正義鏈引物；A.反義鏈引物；.廣泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子基因

S. Sense primer；A. Antisense primer；. Ubiquitously-expressed transcript gene

2 結(jié)果

2.1 山羊KLF12克隆

以山羊脾臟組織cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得基因序列1 315 bp（圖1），其中包括5'UTR 序列52 bp、3'UTR序列54 bp和開(kāi)放閱讀框1 209 bp，基因編碼402個(gè)氨基酸（圖2-A）。提交GenBank獲得登錄號(hào)為：KX247669.1。使用NetPhos 3.1、CD-search及SMART在線軟件預(yù)測(cè)山羊KLF12磷酸化位點(diǎn)以及結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第9、15、33、38、42、48、77、91和92等處存在酪氨酸（Tyr）、絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）的磷酸化位點(diǎn)。此外，在第228—401氨基酸之間存在結(jié)構(gòu)域，其中分別于317—341、347—371及377—399氨基酸之間存在3個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF_C2H2）（圖2-B）。

M：Marker D2000；1：KLF12基因擴(kuò)增序列 The amplified sequence of KLF12

2.2 山羊KLF12生物信息學(xué)分析

使用PSORT Ⅱ進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)山羊KLF12有95.7%存在于細(xì)胞核，4.3%存在于線粒體，無(wú)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。使用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)山羊KLF12無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。比較物種間KLF12典型結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，野牛、綿羊、馬、人和豬等均存在與山羊KLF12相同結(jié)構(gòu)域（圖3-A）。NPSA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示山羊KLF12蛋白序列60個(gè)（14.93%）可能形成α螺旋，253個(gè)（62.94%）可能形成無(wú)規(guī)卷曲，89個(gè)（22.14%）可能形成延伸鏈（圖3-B）。利用Swiss-model在線軟件預(yù)測(cè)獲得山羊KLF12蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如（圖3-C）。進(jìn)一步利用STRING構(gòu)建山羊KLF12蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示KLF12可能與FSBP、SRBD1、MAGEB10、TYWS、TANC2、PARD3B和TFAP2A等蛋白發(fā)生相互作用（圖3-D）。

A：核苷酸序列與氨基酸序列對(duì)比；黑色三角表示磷酸化位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域用灰色底紋表示，方框表示ZnF_C2H2區(qū)域；起始密碼子ATG和終止密碼子TGA用方框表示；擴(kuò)增引物用紅色下劃線標(biāo)出；B：山羊KLF12結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.3 KLF12同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用NCBI及MegAlign軟件對(duì)山羊核苷酸序列與野牛、綿羊、白鯨、馬、豬、人、鼠、雞、黑猩猩、狗和貓的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析如（圖4-A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊與白鯨的同源性最高達(dá)到95.7%，此外與野牛、貓和馬的同源性分別為92.2%、94.8%和95.3%。根據(jù)KLF12的氨基酸序列利用MEGA7.0構(gòu)建了KLF12的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示KLF12在哺乳動(dòng)物之間屬同一分支，山羊KLF12與綿羊和野牛親緣關(guān)系較近（圖4-B）。

2.4 山羊KLF12組織與細(xì)胞時(shí)序表達(dá)譜

qRT-PCR檢測(cè)山羊各組織中mRNA表達(dá)水平（圖5-A）。選擇UXT為內(nèi)參基因[22-23]，以瘤胃表達(dá)水平作對(duì)照。結(jié)果顯示，廣泛表達(dá)于山羊各個(gè)組織，其中心臟和脾臟的表達(dá)水平最高，極顯著高于其他組織（＜0.01），此外在皮下和腹部脂肪也有較高表達(dá)。檢測(cè)mRNA在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化0—96 h的表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，山羊在皮下前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)總體呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，于誘導(dǎo)分化第60小時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值（圖5-B）。

A：不同物種KLF12結(jié)構(gòu)域比對(duì)；B：山羊KLF12二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C：山羊KLF12蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D：山羊KLF12蛋白相互作用預(yù)測(cè)

2.5 干擾KLF12促進(jìn)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化

為進(jìn)一步探究在山羊皮下脂肪細(xì)胞中參與的分子機(jī)制，體外培養(yǎng)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞，待F3代細(xì)胞鋪板至80%時(shí)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的- siRNA，轉(zhuǎn)染完成后更換油酸誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化48 h后收集細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)siRNA干擾效率為50%，如圖6-A。于490 nm處檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-后OD值變化，結(jié)果顯示，干擾后皮下脂肪細(xì)胞甘油三酯含量顯著升高（＜0.05），如圖6-B，表明轉(zhuǎn)染si-后脂質(zhì)堆積能力顯著增強(qiáng)。與此同時(shí)，油紅O染色以及Bodipy染色從形態(tài)學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)抑制的表達(dá)可促進(jìn)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞脂滴聚積（圖6-C）。

2.6 干擾KLF12對(duì)脂肪分化標(biāo)志基因的影響

收集轉(zhuǎn)染si-后誘導(dǎo)分化48 h的細(xì)胞，qPCR檢測(cè)脂肪標(biāo)志基因表達(dá)水平變化（圖7）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中干擾顯著上調(diào)LPL和（＜0.05）的mRNA表達(dá)水平，而顯著下調(diào)了（＜0.01）的mRNA表達(dá)水平。

3 討論

3.1 KLFs是脂肪細(xì)胞分化重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

脂肪組織是一種高度動(dòng)態(tài)的器官，可以介導(dǎo)系統(tǒng)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。成人中，主要的脂肪組織庫(kù)由白色脂肪組成，而白色細(xì)胞膨脹是肥胖癥的標(biāo)志[24-25]。研究表明，脂肪沉積是由脂肪細(xì)胞的數(shù)量和脂滴積累程度決定的，其中脂肪細(xì)胞的增殖和分化是高度協(xié)調(diào)的過(guò)程并受到大量轉(zhuǎn)錄因子以及多種細(xì)胞因子的調(diào)控[26-28]。KLFs家族是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，大量研究已經(jīng)證實(shí)KLFs在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的重要作用。例如，豬前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中干擾的表達(dá)，可顯著抑制、CCATT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCATT/enhancer binding protein alpha，）和脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein，）的表達(dá)進(jìn)而抑制甘油三酯含量和脂滴聚積[29]。張娟娟[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 20a-5p可直接靶標(biāo)并通過(guò)靶向抑制3的表達(dá)促進(jìn)小鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。

圖4 不同物種KLF12同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

用Duncan法表示差異顯著性，不同字母表示P＜0.01. n=6

A：siRNA干擾效率；B：甘油三酯含量；C：油紅O和Bodipy染色；*：P＜0.05；**：P＜0.01

圖7 皮下前體脂肪細(xì)胞中干擾KLF12對(duì)脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響

3.2 KLF12序列分析以及在山羊不同組織的相對(duì)表達(dá)量

本次試驗(yàn)基于NCBI上山羊預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物克隆獲得山羊序列1 315 bp，編碼的402個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)山羊KLF12氨基酸序列具有9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，并存在3個(gè)連續(xù)的典型鋅指結(jié)構(gòu)，與其他物種同源性較高。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示KLF12可能與FSBP、SRBD1、MAGEB10、TYWS、TANC2、PARD3B和TFAP2A等蛋白發(fā)生相互作用。其中Zheng等[31]使用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）研究表明，2是鯉魚(yú)肌肉脂肪含量相關(guān)的潛在候選基因。Kim等[32]利用遺傳力分析（GCTA）和GWAS等方法對(duì)豬和人肥胖性狀研究表明是具有與2型糖尿病相關(guān)的證據(jù)的肥胖候選基因。此外，TFAP2A被證明與葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡相關(guān)遺傳變異轉(zhuǎn)化為2型糖尿病有顯著相關(guān)性[33]。物種之間同源性比較發(fā)現(xiàn)山羊與野牛、綿羊、馬和白鯨等均有較高同源性，分別為92.2%、85%、95.3%和95.7%。與此同時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示與綿羊和野牛親緣關(guān)系最近，這些結(jié)果提示在進(jìn)化過(guò)程中有較高保守性。為闡明山羊功能，本論文利用qRT- PCR技術(shù)構(gòu)建其在山羊各組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在心臟和脾臟的表達(dá)顯著高于其他組織，并且在皮下脂肪和腹部脂肪也有較高的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在腺病毒介導(dǎo)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（HESCs）中過(guò)表達(dá)可顯著抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1（IGFBP-1）的表達(dá)和分泌[34]。如今，IGFBP家族已被確定為與一系列生理過(guò)程有關(guān)的推定信號(hào)分子，可以高親和力結(jié)合胰島素生長(zhǎng)因子（IGF），并在肥胖、糖尿病和心血管疾病中起到重要作用[35-37]。

3.3 KLF12是山羊皮下前體脂肪細(xì)胞的負(fù)調(diào)控因子

以上研究提示在脂代謝和脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中可能扮演重要角色，本次研究利用qRT-PCR方法檢測(cè)在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第60小時(shí)的表達(dá)量達(dá)到峰值。為進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制，將si-轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，干擾表達(dá)可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂滴聚積，推測(cè)在成脂分化過(guò)程中起到負(fù)調(diào)控因子作用。此外，qRT-PCR檢測(cè)脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示，山羊皮下脂肪細(xì)胞中干擾的表達(dá)可顯著上調(diào)和的表達(dá)水平（＜0.05），而極顯著抑制的表達(dá)水平（＜0.01）。研究表明，在脂肪組織中廣泛分布，在棕色脂肪組織中與機(jī)體產(chǎn)熱有關(guān)，在白色脂肪組織中的活性升高有助于脂質(zhì)儲(chǔ)存[38-40]。是葡萄糖和脂質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的核心核受體，是促進(jìn)脂質(zhì)攝取和脂滴形成的促脂肪生成因子[41-42]。是抑制脂肪生成的小鼠脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞的既定標(biāo)記，此外，也是成年女性皮下腹部脂肪基質(zhì)細(xì)胞閑脂肪形成得到負(fù)調(diào)節(jié)劑[43-44]。本次試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染siRNA后表達(dá)水平極顯著降低，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果以及脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)水平變化情況，推測(cè)在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起到負(fù)調(diào)控作用。

4 結(jié)論

克隆獲得具有典型鋅指結(jié)構(gòu)包含完整開(kāi)放閱讀框的山羊序列1 315 bp，編碼402個(gè)氨基酸，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。山羊在心臟，皮下和腹部脂肪中存在較高水平表達(dá)，且在誘導(dǎo)分化60 h的山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中存在高水平表達(dá)。干擾促進(jìn)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞脂滴聚積，并且這種作用是通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因、和的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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[44] MITTERBERGER M C, LECHNER S, MATTESICH M, KAISER A, PROBST D, WENGER N, PIERER G, ZWERSCHKE W. DLK1 (PREF1) is a negative regulator of adipogenesis in CD105+/CD90+/ CD34+/CD31?/FABP4?adipose-derived stromal cells from subcutaneous abdominal fat pats of adult women. Stem Cell Research, 2012, 9(1): 35-48. doi: 10.1016/j.scr.2012.04.001.

Knockdown Goatto Promote Subcutaneous Adipocytes Differentiation

1Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Ministry of Education/Sichuan Province, Southwest Minzu University, Chengdu 610041;2College of Animal Science and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041;3State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193

【】Subcutaneous adipose tissue (SAT) under the skin is an important factor affecting the taste of meat. Exploring the molecular regulation mechanisms of SAT deposition is very important for breeding improvement and the development of animal husbandry. Krüppel-like factors 12 () is a conserved transcription factor that evolutionarily conserved, and it was found that it could be expressed in a variety of cell types and control a wide range of cellular processes. 【】This study aimed to obtain the coding sequence (CDS) of goatand to explore its molecular characteristics. Moreover, the study also intended to clarify the expression pattern of, so as to provide a theoretical basis for further research on the potential role of【】In this study, the goatCDS sequence was cloned by Reverse Transcription PCR ( RT-PCR) method, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of goatwere analyzed on online bioinformatics analysis software. The Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) technology was used to detect the expression levels ofsmall interfering RNA (si-) was chemically synthesized and transfected into goat subcutaneous preadipocyte in vitro by using Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent. Subsequently, 100 μmol·L-1oleic acid induced adipocyte differentiation. Oil red O and Bodipy staining methods and qRT-PCR techniques were used to clarify the effects of interferenceon the accumulation of lipid droplets in subcutaneous preadipocytes and the mRNA expression levels of adipose differentiation marker genes from the perspectives of morphology and molecular biology. 【】The goat(1 315 bp) were successfully obtained, which contained an Open Reading Frame (ORF) (1 209 bp) and encoded 402 amino acids. The subcellular localization results showed that KLF12 was mainly located in the nucleus. In addition, KLF12 had no transmembrane domain and signal peptide but 3 typical zinc finger domains (ZnF_C2H2) at amino acids 317-341, 347-371 and 377-399. Tissue expression profile showed that the expression level of12 in goats’ heart and spleen were significantly higher than that in other tissues (＜0.01). Moreover, during subcutaneous preadipocytes differentiation, the expression level of12 was peaked at 60 h. After transfection of si-into goat subcutaneous preadipocytes, the results of oil red O and Bodipy saining showed that accumulation of lipid droplets in adipocytes were significantly increased. At the same time, the results of qRT-PCR showed that the expression levels of key adipogenic regulatory genes like lipoprotein lipase () and peroxisome proliferator-activated receptor γ () were significantly increased (＜0.05), while the expression level of preadipocyte growth factor () was extremely significantly reduced (＜0.01). Combined with the morphological observation results and the changes in the expression levels of key adipogenic regulatory genes, it was speculated thatplayed a negative regulatory role in the differentiation of subcutaneous adipocytes. 【】By investigating the basic molecular biological characteristics and its expression pattern between tissues and cells of goatand analyzing the potential regulatory effects ofon differentiation process of goat subcutaneous adipocytes, the results suggested thatplayed a negative role in goats subcutaneous preadipocytes differentiation, and this effect achieved by regulating,and, which laid a foundation for further exploring the molecular mechanism of.

goat;; molecular characteristics; knockdown; subcutaneous adipocytes

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.015

2020-11-10；

2021-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金（32072723，31672395）、四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2018JY0036）、西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2020PTJS15004）

杜宇，E-mail：dy17882230767@163.com。通信作者林亞秋，E-mail：linyq1999@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）