超聲耦合雙水相體系提取茶皂素的工藝優化與機制探討

杜金婷，張雁，李雁，王佳佳，廖娜，鐘立煌，駱碧群，林江

超聲耦合雙水相體系提取茶皂素的工藝優化與機制探討

1廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣州 510610；2華南農業大學食品學院，廣州 510640；3廣東星匯生物科技有限公司，廣東龍川 517323

【】茶皂素是一種具有廣闊應用前景的天然活性物質，純度是限制其應用和價值的關鍵因素。探究超聲耦合雙水相提取（Ultrasound-assisted two-phase aqueous extraction, UAATPE）油茶粕茶皂素的工藝條件及其提取機制，以開發純度高且高效的提取技術，為油茶粕高值化利用提供技術指導。以油茶粕為原料，在單因素基礎上，利用Plackett-Burman設計篩選影響得率的關鍵因素，經Box-Behnken設計優化提取工藝；通過比較傳統乙醇提取法和水提法的提取物得率和純度，評價UAATPE法茶皂素提取效果；結合掃描電子顯微鏡分析油茶粕微觀結構，初步探討UAATPE法提取機制。影響茶皂素得率的關鍵因素為乙醇質量分數、硫酸銨質量分數和超聲時間，經Box-Behnken設計優化的最佳工藝參數為：乙醇質量分數27.50%（w/w），硫酸銨質量分數19.60%（w/w），液固比50﹕1，超聲時間32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，在此條件下茶皂素得率為（26.21±0.54）%。與傳統乙醇提取法相比，UAATPE法的茶皂素得率雖差異不顯著，但其純度提高了6.57%（＜0.05）。相較于傳統水提法，UAATPE法提取的茶皂素得率和純度分別提升了17.74%和40.23%（＜0.01）。微觀結構顯示UAATPE法處理的油茶粕因超聲波空化效應，加劇了油茶粕組織破壞，產生大量空洞和強烈表面收縮，有效促進油茶粕茶皂素釋放。UAATPE提取過程，茶皂素在雙水相系統中首先經過固液提取進入電導率高的底相，然后經液液萃取遷移至極性較大的頂相，從而達到初級純化，提升茶皂素純度的效果。采用UAATPE法可以顯著提高茶皂素得率和純度，為油茶粕的高效利用提供了新方法。

油茶粕；茶皂素；超聲波；雙水相提取；Plackett-Burman設計；響應面設計

0 引言

【研究意義】油茶是世界四大油料作物之一，被譽為“東方油橄欖”，2019年我國油茶種植面積已達6 800萬hm2，油茶籽產量達267萬t，經榨油后可產生100多萬t油茶粕[1-2]。茶油是具有食療雙重功能的一種食用油，相較于橄欖油，其具有更高的不飽和脂肪酸及能有效改善心腦血管疾病、降低膽固醇并抑制癌細胞生物活性物質的茶多酚和山茶甙[3-4]。油茶粕是一種富含茶皂素且可產生較高經濟價值的加工副產物，然而其綜合利用程度低，目前主要用于生產燃料和清塘劑，經濟效益不高。茶皂素具有抗菌、胃腸保護、抗癌、降血脂等[5-8]生物活性和良好的表面活性，在醫藥、農業、工業和環境保護等領域具有廣闊的應用前景。茶皂素純度是限制其應用領域和經濟價值的關鍵因素，目前市場上流通的多為低純度茶皂素，而低純度茶皂素無法應用于食品和醫藥等領域且經濟價值較低。因此，尋找簡單高效、提取純度高且低成本的提取技術以運用于工業生產具有重要意義。【前人研究進展】由于茶皂素結構復雜，使其提取困難[9]，傳統提取方法有水提法和有機溶劑法，但都存在提取效率不高、純度較低等問題。李揚[10]采用水提法提取茶皂素，提取時間3.5 h時茶皂素得率為22.09%，侯如燕[11]采用水提法提取茶皂素，純度僅為45.23%；筆者課題組前期建立了茶皂素連續多級逆流水提工藝[12]，相較于傳統的單級水提取技術，極大縮短了提取時間，但在提取物得率和純度方面尚無較大突破；水提法工藝簡單、成本較低，但提取物純度低，限制了后續應用。孫萬里[13]以乙醇為提取劑提取茶皂素，得率為21.5%，于輝等[14]采用正丙醇提取茶籽粕中茶皂素，提取物純度為62.78%；與水提法相比，有機溶劑法提取物茶皂素純度有顯著提高，但存在溶劑成本高的問題。近年來，在有效成分提取及利用方面，輔助技術與雙水相體系結合的新方法因其效率高、能耗低且不破壞物質結構的優點受到很多關注。LIN等[15]利用微波輔助雙水相提取香菇多糖，其提取率和純度皆高于熱回流提取法和單一微波提取法。ZHAO等[16]采用微波輔助雙水相提取黑加侖皮多酚，多酚結構無破壞，且對食源性病原菌的抗菌效果與標準品無顯著差異。【本研究切入點】目前關于茶皂素提取方法的研究主要集中在有機溶劑提取與輔助技術相結合等方面，雙水相萃取因其效率高、成本低及活性物質損失少等優點，已廣泛應用于蛋白純化和抗生素提取，但關于天然活性成分雙水相提取工藝的研究報道較少，而采用輔助技術與雙水相體系結合提取茶皂素的研究尚未見報道。因此，探究雙水相體系與超聲輔助技術耦合的提取工藝及機制，可以提升茶皂素純度，降低生產成本，提高油茶粕深加工產品的附加值。【擬解決的關鍵問題】采用Plackett-Burman和響應面設計確定UAATPE法提取油茶粕茶皂素最佳工藝參數，以茶皂素得率和純度兩個考察指標評價UAATPE法對油茶粕茶皂素的提取效果；同時結合掃描電子顯微鏡分析UAATPE法提取的油茶粕微觀結構，對其提取機制進行初步分析，以期為油茶加工副產物油茶粕的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

試驗于2020年9月至2021年5月在廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所進行。

1.1 材料與試劑

油茶粕：由廣東星匯生物科技有限公司提供，油茶籽產自廣東省河源市龍川縣黃石鎮長洲村，于2020年11月采收，脫脂油茶粕基本成分含量（以干基計）：茶皂素29.75%，糖類28.56%，粗蛋白22.96%；茶皂素標準品（純度≥98%）：購于北京譜析科技有限公司；硫酸銨、磷酸氫二鉀：購于福晨（天津）化學試劑有限公司，均為分析純；色譜級甲醇：購于北京邁瑞達科技有限公司；冰乙酸：購于天津市科密歐化學試劑有限公司，高效液相色譜儀專用。

1.2 儀器與設備

BSA4202S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；QUINTIX224-1CN分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；M308073漩渦混合器，北京中西華大科技有限公司；AIIera X 64R臺式冷凍高速離心機，美國貝克曼庫爾特公司；SB25-12DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SOX416脂肪測定儀，德國格哈特分析儀器有限公司；LC1260高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；S-3400N-II掃描電子顯微鏡，日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）相圖繪制 在25℃室溫下，通過濁點滴定法確定相圖，將一定量的(NH4)2SO4或K2HPO4分別添加到裝有去離子水的試管中，隨后將乙醇滴加到每個試管中，直到溶液變渾濁為止，將溶液首先變得渾濁的點定義為濁點，記錄乙醇添加量，分別以濁點出現時對應的鹽和乙醇的質量分數為橫縱坐標繪制相圖。

1.3.2 ATPS的篩選 制備乙醇質量分數為25%，鹽質量分數為20%的兩種雙水相系統，將(NH4)2SO4或K2HPO4分別溶解在去離子水中，通過渦旋攪拌器將鹽溶液與乙醇混合，當混合物在濁點處出現兩相分離，就會形成雙水相系統。將0.5 g樣品和25 g雙水相系統放入離心管中，然后密封放入超聲波清洗儀，在50℃、300 W的條件下超聲提取30 min，冷卻離心后，清液進一步分為兩相，并將頂部和底部分別收集，測定茶皂素含量。通過茶皂素分配系數（K）、回收率（R）和相比（α）來評估提取效果，其計算如下：

×100% （2）

（3）

式中，CT：頂相茶皂素濃度（mg?mL-1）；CB：底相茶皂素濃度（mg?mL-1）；mT：頂相中茶皂素含量；mB：底相中提取的茶皂素含量；Vtop：頂相體積；Vbottom：底相體積。

1.3.3 超聲耦合雙水相提取流程 將油茶粕置于烘箱內，60℃烘干24 h，研磨，過80目篩，再經索氏提取器脫脂。準確稱量0.5 g脫脂油茶粕粉置于裝有一定梯度乙醇質量分數、鹽質量分數的25 g雙水相系統的50 mL離心管中，密封后置于超聲清洗儀，實時監測水溫，并用碎冰控制溫度恒定。在一定提取溫度、超聲時間和超聲功率下進行提取，提取結束后7 000 r/min、20℃離心10 min，收集上清液，用于試驗分析。

1.3.4 茶皂素得率測定

1.3.4.1 液相條件 采用文獻報道的方法，略有修改[17]。流動相A：甲醇；B：0.4%乙酸溶液；流速：1.0 mL?min-1；檢測波長：280 nm；色譜柱：inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量：20 μL；柱溫：40℃。

梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

1.3.4.2 專屬性試驗 精密吸取標準品溶液、提取液，依法測定，記錄色譜圖（圖1）。提取液色譜中，在與標準品溶液色譜相應位置上有相同保留時間的色譜峰。

圖1 標準品（A）、提取液樣品（B）HPLC色譜

1.3.4.3 茶皂素得率測定 采用高效液相色譜測定茶皂素得率，準確稱取80 mg茶皂素標準品，用50%乙醇溶劑溶于10 mL容量瓶中，定容配成8 mg?mL-1的標準溶液，吸取5 mL標準溶液于10 mL具塞試管，加入5 mL 50%乙醇，配成4 mg?mL-1的標準溶液，依次稀釋配置2、1和0.5 mg?mL-1的標準溶液。在高效液相色譜條件下測定峰面積，以峰面積為縱坐標，茶皂素濃度（mg?mL-1）為橫坐標，得到茶皂素回歸方程為：=119578.90+232.21，2=0.9998，線性相關性良好。過濾茶皂素提取液后用分液漏斗將上、下兩相分離，取茶皂素提取上清液定容至50 mL后，采用高效液相色譜法測定茶皂素濃度，進一步代入以下公式計算茶皂素得率。

式中，：提取液中茶皂素濃度（mg?mL-1），M0：油茶粕質量（mg）。

1.3.4.4 茶皂素純度測定 將茶皂素提取液旋轉蒸發至膏狀，之后放入烘箱中烘干至恒重得茶皂素提取物。將一定質量茶皂素提取物定容于10 mL容量瓶，取適量茶皂素溶液，采用高效液相色譜法測定茶皂素濃度，進一步代入以下公式計算茶皂素純度：

式中，：茶皂素濃度（mg?mL-1），M1：茶皂素提取物質量（mg）。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 乙醇質量分數 固定硫酸銨質量分數為20%、液固比為40﹕1、超聲功率為300 W、超聲波提取時間30 min、提取溫度50℃，乙醇質量分數分別設為22%、24%、26%、28%和30%進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.5.2 硫酸銨質量分數 固定乙醇質量分數為25%、液固比為40﹕1、超聲功率為300 w、超聲波提取時間30 min、提取溫度50℃條件下，硫酸銨質量分數分別設為18%、20%、20%、22%和24%進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.5.3 液固比 固定乙醇質量分數為25%、硫酸銨質量分數為20%、超聲功率為300 w、超聲波提取時間30 min、提取溫度50℃條件下，液固比分別設為20﹕1、30﹕1、40﹕1、50﹕1和60﹕1進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.5.4 超聲波功率 固定乙醇質量分數為25%、硫酸銨質量分數為20%、液固比為40﹕1、超聲波提取時間30 min、提取溫度50℃條件下，超聲波功率分別設為200、250、300、350和400 W進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.5.5 超聲時間 固定乙醇質量分數為25%、硫酸銨質量分數為20%、液固比為40﹕1、超聲功率300 W、提取溫度50℃條件下，超聲波提取時間分別為20、30、40、50和60 min進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.5.6 提取溫度 固定乙醇質量分數為25%、硫酸銨質量分數為20%、液固比為40﹕1、超聲功率300 W、超聲波提取時間30 min條件下，提取溫度分別設為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃進行茶皂素提取，測定茶皂素得率。

1.3.6 Plackett-Burman試驗 根據單因素試驗結果，選取高、低兩個水平進行Plackett-Burman試驗，分析比較上述各因素效應值及其顯著性篩選出顯著影響茶皂素得率的因素。Plackett-Burman設計因素和水平見表2。

表2 Plackett-Burman設計的因素和水平

1.3.7 響應面試驗設計 采用Design Expert 8.0.6軟件，以茶皂素得率為響應值，采用中心組合試驗Box-Behnken Design（BBD），選定乙醇質量分數，硫酸銨質量分數，超聲時間為自變量進行三因素三水平試驗設計并對結果進行分析。試驗因素及水平如表3所示。

表3 Box-Behnken 試驗因素與水平

1.3.8 不同提取方法對比 為評價超聲輔助雙水相提取法的提取效果，與提取時間60 min、液固比10﹕1和溫度80℃條件下的傳統乙醇提取法和水提法的茶皂素得率和產品純度進行對比[18-19]。

1.3.9 不同提取方法的油茶粕微觀結構 用掃描電子顯微鏡觀察不同提取方式對油茶粕表面微觀結構的影響，初步探討UAATPE法對油茶粕茶皂素的提取機制。

1.4 數據分析

每組試驗重復3次，試驗數據值以均值±標準差表示，采用Design Expert 8.0.6響應面設計軟件對數據進行相應分析；采用SPSS 19軟件對HPLC試驗數據進行顯著性差異分析（＜0.05，差異顯著；＜0.01，差異極顯著）；采用Excel 2019、Origin2021對數據進行統計分析及制圖。

2 結果

2.1 雙水相系統研究

2.1.1 雙水相系統相圖 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4兩個典型的低分子有機溶劑/鹽雙水相系統具有相分離快、系統穩定透明的特點[20]，相圖曲線描繪了兩相區域，在曲線上方為系統兩相區，該區域頂相是富含乙醇的醇相，底層是富含鹽的水相，而在曲線下方則呈現渾濁溶液。由圖2可知，乙醇/(NH4)2SO4系統的鹽濃度上限約為35%（w/w），醇濃度上限約為60%（w/w），而乙醇/K2HPO4具有相似的鹽濃度上限，然而其醇濃度上限約為45%（w/w），略低于乙醇/(NH4)2SO4系統。

2.1.2 雙水相系統篩選 如圖3所示，乙醇/K2HPO4系統對茶皂素提取的分配系數（K）和回收率（R）均略高于乙醇/(NH4)2SO4系統，但無顯著性差異（＞0.05），但乙醇/K2HPO4系統相比為3.14，是乙醇/(NH4)2SO4相比（0.93）的3.38倍。相較于分配系數和回收率，合適的相比（α）是一個更為重要的參數[21]，且相比在0.7—1.2范圍內具有較優的提取效果[20]，綜合考慮分配系數、回收率、相比和提取物的富集及操作簡便性，選用乙醇/(NH4)2SO4作為提取試驗的雙水相系統。

2.1.3 雙水相系統兩相形成區研究 兩相形成區的研究可為進一步優化UAATPE的系統組成提供有效指導，圖4顯示，乙醇濃度從9.79%—37.63%（w/w），鹽濃度從8.14%—30.07%（w/w）可適用于提取。綜合考慮相比的適宜范圍及圖4中相比的研究結果，選用硫酸銨濃度為16%—24%（w/w），乙醇濃度為22%—30%（w/w）作為單因素優化范圍。

圖2 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系統相圖

圖3 茶皂素在乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系統提取中的分配系數（K）、回收率（R）和相比（α）

圖4 乙醇/(NH4)2SO4雙水相體系相比

2.2 茶皂素提取單因素試驗

2.2.1 乙醇質量分數 當乙醇質量分數在22%— 30%，茶皂素得率隨著乙醇質量分數增加呈現先增加后減少的趨勢（＜0.05），而當乙醇質量分數為28%時，茶皂素得率最大（圖5）。在一定范圍內，隨著乙醇質量分數的增加，頂相中有機溶劑的含量會增大，這有助于提升頂相提取能力[22]；而當乙醇質量分數過高時，頂相會溶解醇溶性雜質、色素等，從而降低茶皂素在頂相中的溶解度，導致得率降低[23]。因此，乙醇質量分數選擇26%、28%、30%三個水平進行組合試驗。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2.2 硫酸銨質量分數 當硫酸銨質量分數在16%—20%，茶皂素得率呈輕微上升趨勢（圖6），可能是由于硫酸銨質量分數的增加使有機相中水分降低極性增強，進而增加茶皂素溶解度和擴散系數，促使茶皂素由內向外擴散[24]，提升茶皂素得率。然而上升趨勢不顯著可能是由于硫酸銨質量分數在16%—18%時，雙水相體系較不穩定，成相能力較低。而當硫酸銨質量分數超過20%時，茶皂素得率隨硫酸銨質量分數的增加呈現顯著降低的趨勢（＜0.05）。這可能是由于硫酸銨質量分數的增加，上相趨于飽和狀態，隨后繼續增加硫酸銨質量分數會使頂相中的茶皂素向底相遷移。此外，硫酸銨質量分數過高會使雙水相體系中硫酸銨沉淀析出，影響茶皂素浸出[25]，導致分配系數下降，從而降低茶皂素得率。因此，硫酸銨質量分數選擇18%、20%、22%三個水平進行組合試驗。

2.2.3 液固比 茶皂素得率隨著液固比增加呈現先增加后顯著降低的趨勢（＜0.05），當液固比達到50﹕1時，茶皂素得率取得最大值（圖7）。其原因可能是隨著液固比的增加，溶劑滲透并擴散到油茶粕細胞內，造成細胞內外濃度梯度增大，而濃度梯度作為傳質動力促進油茶粕中茶皂素釋放[26]；另外，溶劑在油茶粕細胞內可破壞疏水鍵，增加油茶粕中茶皂素由內向外的擴散速率，使其得率提高[27]。但當液固比超過50﹕1時，茶皂素得率顯著降低（＜0.05），其原因可能是由于液固界面存在傳質極限，細胞內外濃度梯度差趨于零，體系已經達到飽和狀態，過量溶劑不但稀釋茶皂素，而且也會使后續茶皂素的分離更難[28]。綜上所述，液固比選擇40﹕1、50﹕1、60﹕1三個水平進行組合試驗。

圖6 硫酸銨質量分數對茶皂素得率的影響

2.2.4 超聲波功率 隨著超聲波功率的增大，茶皂素得率逐漸增加，但在300 W后出現顯著下降（＜0.05）（圖8），這是因為超聲波空化作用有利于茶皂素從細胞壁中釋放，但當超聲波功率過大時，可能會破壞茶皂素的結構[29]。研究表明，皂苷類物質在功率過高的超聲波作用下會造成糖苷分離，導致皂苷降解，進而使茶皂素得率降低[30-31]。因此，從降低能耗和得到高品質茶皂素的角度考慮，超聲波功率選擇250、300和350 w三個水平進行組合試驗。

圖7 液固比對茶皂素得率的影響

圖8 超聲波功率對茶皂素得率的影響

2.2.5 超聲時間 茶皂素得率隨著超聲時間延長，呈現顯著增加的趨勢（＜0.05），后又呈顯著下降（＜0.05），在40—60 min時，提取率沒有顯著性變化（＜0.05）（圖9）。可能是因為在提取初期，茶皂素在較大的濃度梯度下，容易從細胞內擴散到周圍溶劑中，使茶皂素得率顯著增加[32]。后期隨著時間的延長，乙醇揮發量增加，會引起提取效果下降，此外長時間提取可能會增加茶皂素的水解程度，破壞茶皂素分子結構，從而致使提取率隨之降低。因此，超聲時間選擇20、30和40 min三個水平進行組合試驗。

圖9 超聲時間對茶皂素得率的影響

2.2.6 提取溫度 茶皂素得率隨著提取溫度的增加呈現先升高后下降的趨勢，提取溫度為60℃時得率最高（圖10），這可能是由于乙醇受熱易揮發，過高的提取溫度會使雙水相體系中乙醇揮發，降低其提取能力，從而影響茶皂素得率。因此，提取溫度選擇50℃、60℃、70℃三個水平進行組合試驗。

2.3 Plackett-Burman設計試驗

以茶皂素得率為考察指標，用Design expert軟件對試驗數據進行處理，試驗結果如表4，各因素的顯著性分析如表5，由于模型的＜0.05，可知該模型具有顯著性影響，6個因子影響大小排序為超聲時間＞乙醇質量分數＞硫酸銨質量分數＞超聲功率＞提取溫度＞液固比，其中乙醇質量分數、硫酸銨質量分數和超聲時間對茶皂素提取具有顯著性影響（＜0.05），因此，選用以上3種因素進行響應面設計試驗。

圖10 提取溫度對茶皂素得率的影響

2.4 提取油茶粕茶皂素響應面試驗結果分析

2.4.1 響應面試驗設計與結果 在單因素試驗結果的基礎上，確定提取溫度為60℃，液固比為50﹕1，超聲功率為300 W，以乙醇質量分數、鹽質量分數、超聲時間為自變量，以茶皂素得率為響應值，采用響應面進行三因素三水平的試驗設計，共包括17組試驗方案，試驗結果見表6。

2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design expert軟件，選擇Box-Behnken Design模型，對試驗設計中各組的茶皂素提取量進行回歸分析，得到回歸方程如下：

=26.58-0.461-0.382+0.253+1.3812-0.5113+0.1223-1.6212-1.9322-0.7932（6）

式中，：油茶粕茶皂素得率（%）；1：乙醇質量分數（%）；2：硫酸銨質量分數（%）；3：超聲時間（min）。

分析發現，該模型值為61.17（＜0.0001），說明所選模型差異極顯著。失擬項值為0.7464（＞0.05），失擬項不顯著，表明試驗結果和該模型擬合度高，該模型能較好地預測茶皂素的提取效果（表7）。由自變量值大小可知，各因素對油茶粕茶皂素得率的影響依次為：1（乙醇質量分數）＞2（硫酸銨質量分數）＞3（超聲時間）。由自變量的值可知，因素1、2、12、13、12、22、32差異極顯著（＜0.01），3差異顯著（＜0.05），其他項差異不顯著。

表4 Plackett-Burman試驗設計及結果

表5 Plackett-Burman試驗方差分析

*表示差異顯著（＜0.05） * indicate significant difference (＜0.05)

回歸模型的決定系數2=0.9874，調整決定系數2adj=0.9713，說明該模型的擬合程度較好，可以利用該模型對超聲輔助雙水相提取油茶粕茶皂素進行分析及預測。變異系數為1.16%，表明試驗的重復性好，試驗結果可靠。綜上所述，可以采用該模型的試驗結果進行分析，確定超聲輔助雙水相提取油茶粕茶皂素的最優參數條件。

2.4.3 兩因子間交互作用分析 圖11各圖是由響應值和各試驗因子構成的立體曲面圖，顯示乙醇質量分數、硫酸銨質量分數和超聲時間中任意兩個變量取零水平時，變量對油茶粕茶皂素得率的影響。

圖11-a顯示茶皂素得率隨著硫酸銨質量分數和乙醇質量分數的增大而增大，到達中心點后開始下降。圖11-b表明茶皂素得率是隨超聲時間和乙醇質量分數的增大而增大，達到最大值后開始逐步下降。圖11-c表明隨著超聲時間的增加，茶皂素得率先增加后減小，而硫酸銨質量分數對茶皂素得率的影響也表現為此趨勢。從圖中等高線密度可以看出，乙醇質量分數的等高線密度最大，而硫酸銨質量分數和超聲時間的等高線密度差異不大，表明乙醇質量分數對茶皂素得率的影響最大，其次為硫酸銨質量分數和超聲時間。

表6 響應面分析試驗設計及結果

表7 回歸模型方差分析

*表示差異顯著（＜0.05）；**表示差異極顯著（＜0.01）

* indicate significant difference (＜0.05); ** indicate extremely significant difference (＜0.01)

圖11 乙醇質量分數（x1）、硫酸銨質量分數（x2）和超聲時間（x3）對茶皂素得率影響的響應曲面圖

2.4.4 最優提取條件的確定與驗證 利用Design Expert軟件優化試驗數據，得出超聲耦合雙水相提取茶皂素的最佳工藝參數為：乙醇質量分數27.485%，硫酸銨質量分數19.636%，超聲時間32.323 min，超聲功率300 w，提取溫度60℃，液固比50﹕1，在此條件下茶皂素的預計得率為26.704%。為了檢驗上述優化結果，本試驗利用優化后的參數進行驗證。考慮到實際的可行性和便利性，修正提取工藝為乙醇質量分數為27.50%，硫酸銨質量分數為19.60%，超聲時間為32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，液固比50﹕1，在此條件下做3次平行試驗的茶皂素得率為（26.21±0.54）%，與理論值相比，相對誤差為2.47%，說明該模型可以較好地預測UAATPE提取茶皂素的得率，驗證了優化提取條件的可靠性。

2.5 不同提取方法的比較

在本試驗UAATPE優化條件下進行提取，由表8可知，在提取時間縮短28 min，提取溫度降低20℃的情況下，與傳統乙醇提取法相比，茶皂素得率無顯著性差異（＞0.05），但提取物純度顯著增加（＜0.05），提高了6.57%，此時乙醇質量分數僅為27.50%；相較于傳統水提法，茶皂素得率極顯著增加（＜0.01），提升了17.74%，同時茶皂素純度極顯著增加（＜0.01），提升了40.23%。

2.6 不同提取方法處理油茶粕微觀結構

物質提取效果與植物組織細胞壁的物理變化存在一定關系，且不同提取方法處理下，油茶粕組織結構的物理變化有顯著差異。油茶粕組織樣品經過粉碎處理后（圖12-a），其組織結構表面較為光滑，粉碎處理對樣品的破壞程度較小。相較于未經提取處理的油茶粕組織樣品，乙醇提取法、UAATPE和水提法處理后（圖12-b—d）的油茶粕樣品組織結構皆受到不同程度的破壞。水提法處理后的油茶粕粉末表面呈現一定的褶皺，但多為光滑平面，而乙醇提取法處理后的組織樣品出現一定松散和空洞，兩種處理方式對樣品的破壞程度皆較小。然而經UAATPE法處理后，油茶粕組織樣品破損程度較為嚴重，出現了大量孔洞的同時還出現較為嚴重的表面收縮，這可能是由于超聲波的細胞空化效應，加劇了油茶粕組織的破壞[20]，因而促進了油茶粕植物細胞中茶皂素的釋放。

表8 不同提取方法比較

不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (＜0.05)

a：油茶粕粉碎樣品；b：傳統乙醇提取法處理后油茶粕樣品；c：超聲耦合雙水相提取法處理后油茶粕樣品；d：水提取法處理后油茶粕樣品

3 討論

3.1 雙水相體系選擇與茶皂素提取效果的相關性

雙水相系統是指一種或幾種物質以適當質量分數溶解在水相中，在一定條件下形成互不相溶的水溶液體系，如聚合物/聚合物/水、聚合物/無機鹽/水、聚合物/有機鹽/水、表面活性劑/表面活性劑/水、小分子有機溶劑/無機鹽/水等體系[33]。研究表明，ATPS體系對多種生物活性物質具有良好的提取純化效果，這很大程度上取決于兩相體系的選擇，而其中以低分子有機溶劑和無機鹽組成的雙水相體系最為典型。LI等[34]采用雙水相提取海棠多糖，評價了5種鹽（(NH4)2SO4、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2CO3）與乙醇組成的ATPS體系對海棠多糖的提取效果，5種ATPS體系對多糖提取效果有顯著性差異，其中以硫酸銨/乙醇/水體系最優。SHAKER等[35]發現聚合物/鹽/水ATPS體系更適合姜黃素的純化，其中以PEG6000/Na2SO4/水為最佳提取體系。由此可見，雙水相體系可就不同天然活性物質的物理性質進行專一性設計。

在采用小分子有機溶劑/無機鹽/水ATPS體系提取茶皂素過程中，低分子有機溶劑和無機鹽的種類對茶皂素分配系數有重要影響，Ng等[36]研究表明低分子有機溶劑的烷基鏈短，疏水性較低，有助于物質遷移到富含醇的頂相，提高其分配系數和回收率，進而使提取物得率和純度提高。而JIANG等[37]研究發現無機鹽種類也可影響提取效果，磷酸鹽與硫酸鹽和檸檬酸鹽相比，具有較低的鹽析效應，這可促進提取物遷移到富含有機溶劑的頂相。基于此，本研究選定乙醇作為提取體系的低分子有機溶劑，此外根據茶皂素是三萜類皂苷，結構側鏈上多為羧基，顯酸性的特性[38]，針對性選擇強酸弱堿鹽(NH4)2SO4及呈現弱堿性的K2HPO4作為分相鹽進行體系篩選。根據Hofmeister規律可知，(NH4)2SO4與K2HPO4具有相近的鹽析能力[39]，同時本研究關于體系篩選的分析結果也表明，乙醇/(NH4)2SO4及乙醇/K2HPO4對茶皂素的提取效果相近，兩者分配系數和回收率都無顯著性差異。然而，相較于分配系數和回收率，相比是評價提取體系是否適當的關鍵指標[37]。結合本研究關于雙水相相圖和體系篩選研究結果與辜鵬[40]對分相時間的研究可知，乙醇/(NH4)2SO4體系分相范圍更廣，分相能力更強且相比適中，更加適用于茶皂素提取。綜上，本研究在縮短提取時間和降低有機溶劑使用量的情況下，UAATPE法顯示出良好的提取效果，其顯著提升了提取物茶皂素得率和純度。

3.2 UAATPE法對油茶粕茶皂素提取過程的影響

超聲波是一種在傳播過程中形成交替正壓和負壓的高頻彈性波，油茶粕植物細胞中的空化氣泡在超聲波頻率帶動下達到共振，產生空化氣泡的膨脹破裂，當到達極限爆裂時，氣泡內將產生極高溫度和壓強，造成油茶粕細胞組織結構瞬間破壞，加速細胞內容物向溶劑的擴散速度[41]。如提取示意圖（圖13）顯示，UAATPE法提取茶皂素是一個動態的復雜過程，相較于傳統提取法，油茶粕樣品位于富含鹽的底相和富含醇的頂相之間，UAATPE法提取茶皂素經歷了兩個階段，第一階段：在超聲波引起的強烈空穴效應和熱效應下，油茶粕細胞組織瞬間破壞，植物細胞內容物快速擴散至具有高電導率的含鹽底相，加速茶皂素等成分與油茶粕基質分離。本研究中UAATPE法提取后的油茶粕掃描電子顯微鏡圖也顯示，超聲波可使油茶粕產生大量空洞，同時對比傳統乙醇提取法可知超聲波作用顯著提升了茶皂素提取效率。UAATPE法提取前期主要以固液提取為主，茶皂素不斷富集到底相，同時在機械與空化效應提供的攪拌作用下，雙水相頂相與底相充分接觸，促進了茶皂素在底相與頂相之間的液液萃取。第二階段：體系主要進行的是茶皂素在富含鹽的底相和富含有機溶劑的頂相之間的選擇性分配，分配規律服從能斯特分配定律，該過程以液液萃取為主。本研究中體系篩選時茶皂素回收率高達80%以上，這表明ATPS體系實現了對茶皂素與雜質的兩相選擇性分配，使茶皂素在上相富集，而進一步與傳統水提法的比較則證明正是這種選擇性分配使茶皂素純度顯著上升。雙水相體系對茶皂素的選擇性分配是因為茶皂素是一類五環三萜類皂苷，水溶液呈弱酸性，茶皂素分子結構中含有羧基、羥基、羰基等，從酸堿平衡的角度可以把茶皂素看做二元弱酸，同時根據雙水相萃取的相似相溶原理，在此過程中茶皂素將優先分配到極性較小的富含有機溶劑的頂相。此外，這種選擇性分配還受到多種作用力（分子間作用力、靜電力、分子空間阻礙力等）的影響，茶皂素在雙水相體系中分配系數如下式所示：=a+b+c，式中：a為氫鍵作用力，b為靜電力，c為其他作用力[33]。

本研究結果顯示，在超聲波作用下，油茶粕微觀結構出現大量空洞和嚴重表面收縮，促進油茶粕植物細胞內茶皂素釋放，提高其得率，同時雙水相體系可使茶皂素與雜質在兩相內進行選擇性分配，進而提升茶皂素純度；此外，UAATPE法提取時，茶皂素先是經過固液提取從油茶粕中進入底相，然后經液液萃取遷移至頂相，使茶皂素在含有機溶劑的頂相富集，而低聚糖、小分子多糖及有機酸等水溶性雜質則在水相富集，進而提升頂相茶皂素純度，達到初級純化的效果。

圖13 UAATPE法茶皂素動態提取過程示意圖

4 結論

采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計優化得到超聲耦合乙醇/硫酸銨雙水相體系提取油茶粕茶皂素的最佳提取工藝條件為：乙醇質量分數為27.50%，硫酸銨質量分數為19.60%，超聲時間為32 min，超聲功率300 W，提取溫度60℃，液固比50﹕1，提取物茶皂素的得率為（26.21±0.54）%，純度為（66.09±0.04）%。超聲波耦合雙水相提取作為一種低成本且高效率的新型技術，可為農產品加工副產物中生物活性成分的提取提供新思路。

[1] ZHAO Y, SU R Q, ZHANG W T, YAO G L, CHEN J. Antibacterial activity of tea saponin fromshell by novel extraction method. Industrial Crops and Products, 2020, 153: 112604.

[2] 楊友志, 賴瓊瑋, 譚傳波, 駱金杰, 張帆, 周魁香, 吳丹, 周娟. 油茶籽粕綜合利用研究進展. 糧食科技與經濟, 2020, 45(11): 138-142.

YANG Y Z, LAI Q W, TAN C B, LUO J J, ZHANG F, ZHOU K X, WU D, ZHOU J. Research progress on comprehensive utilization ofseed meal. Grain Science and Technology and Economy, 2020, 45(11): 138-142. (in Chinese)

[3] 高偉, 幸偉年, 龔春, 徐林初. 茶油的營養價值和開發前景. 江西林業科技, 2013(4): 52-55.

GAO W, XING W N, GONG C, XU L C. Nutritional value and development prospects ofoil. Jiangxi Forestry Science and Technology, 2013(4): 52-55. (in Chinese)

[4] 馬力. 茶油與橄欖油營養價值的比較. 糧食與食品工業, 2007, 14(6): 19-21.

MA L. Comparison ofoil and olilve oil in nutritional value. Cereal & Food Industry, 2007, 14(6): 19-21. (in Chinese)

[5] JEEPIPALLI S P K, DU B, SABITALIYEVICH U Y, XU B J. New insights into potential nutritional effects of dietary saponins in protecting against the development of obesity. Food Chemistry, 2020, 318: 126474.

[6] WANG Y M, REN N, RANKIN G O, LI B, ROJANASAKUL Y, TU Y Y, CHEN Y C. Anti-proliferative effect and cell cycle arrest induced by saponins extracted from tea () flower in human ovarian cancer cells. Journal of Functional Foods, 2017, 37: 310-321.

[7] DEL HIERRO J N, HERRERA T, FORNARI T, REGLERO G, MARTIN D. The gastrointestinal behavior of saponins and its significance for their bioavailability and bioactivities.Journal of Functional Foods, 2018, 40: 484-497.

[8] KHAN M I, AHHMED A, SHIN J H, BAEK J S, KIM M Y, KIM J D. Green tea seed isolated saponins exerts antibacterial effects against various strains of gram positive and gram negative bacteria, a comprehensive studyand. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine, 2018, 2018: 3486106.

[9] 干麗. 油茶餅粕中茶皂素苷元的制備與分析研究[D]. 長沙: 湖南中醫藥大學, 2015.

GAN L. Study on the preparation of tea saponin aglycone from tea cake [D]. Changsha: Hunan University of Chinese Medicine, 2015. (in Chinese)

[10] 李揚. 茶皂素提取及其洗滌產品的開發研究[D]. 廣州: 華南農業大學, 2016.

LI Y. Study on the extraction of camellia saponin and its detergent products development [D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[11] 侯如燕. 茶皂素提取純化及其抗菌活性研究[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2002.

HOU R Y. Studies on teasaponins’ extraction and isolation and its antifungi actibities [D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2002. (in Chinese)

[12] 王佳佳, 李國琰, 張雁, 廖娜, 魏振承, 李巧玲. 油茶粕中茶皂素連續多級逆流水提工藝的建立. 食品科學技術學報, 2021, 39(1): 153-161.

WANG J J, LI G Y, ZHANG Y, LIAO N, WEI Z C, LI Q L. Establishment of continuous multi-stage countercurrent water extraction process of tea saponin frommeal. Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(1): 153-161. (in Chinese)

[13] 孫萬里. 乙醇提取茶皂素的研究. 糧食與油脂, 2019, 32(3): 22-24.

SUN W L. Study on ethanol extraction tea saponin. Cereals & Oils, 2019, 32(3): 22-24. (in Chinese)

[14] 于輝, 陳海光, 吳波, 任文彬. 正丙醇提取茶皂素工藝. 食品科學, 2013, 34(2): 58-62.

YU H, CHEN H G, WU B, REN W B. Optimization of extraction process for tea saponin fromseed meal with n-propanol. Food Science, 2013, 34(2): 58-62. (in Chinese)

[15] LIN Y Y, ZENG H Y, WANG K, LIN H, LI P F, HUANG Y X, ZHOU S Y, ZHANG W, CHEN C, FAN H J. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of diverse polysaccharides from: Process optimization, structure characterization and antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 136: 305-315.

[16] ZHAO M M, BAI J W, BU X Y, TANG Y, HAN W Q, LI D L, WANG L B, YANG Y, XU Y Q. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of phenolic compounds fromL. and its antibacterial effect on foodborne pathogens. Food Control, 2021, 119: 107449.

[17] 尹麗茸, 張建華, 宋光艷, 阿拉西·斯爾克米德克, 郭夢琦, 鐘耀廣. HPLC-TOF/MS測定茶籽粕中的茶皂素主要成分. 中國糧油學報, 2013, 28(12): 97-101.

YIN L R, ZHANG J H, SONG G Y, ARASI SILKMIDEC, GUO M Q, ZHONG Y G. Determination of main components of tea saponin in tea seed meal by HPLC-TOF / MS. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2013, 28(12): 97-101. (in Chinese)

[18] 易醒, 孟培, 侯海濤, 肖小年, 桂靜芬, 劉喚. 二次通用旋轉組合設計優化油茶枯中茶皂素的提取工藝. 中國食品學報, 2017, 17(9): 90-98.

YI X, MENG P, HOU H T, XIAO X N, GUI J F, LIU H. Optimization of technological conditions for saponin extraction fromseed pomace by quadratic general spinning design. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017, 17(9): 90-98. (in Chinese)

[19] 張武君, 黃穎楨, 張玉燦. 超聲提取苦瓜皂苷的工藝優化研究. 中國農學通報, 2015, 31(34): 273-277.

ZHANG W J, HUANG Y Z, ZHANG Y C. Optimization of ultrasonic extraction process for balsam pear saponin. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(34): 273-277. (in Chinese)

[20] ZHANG W, ZHU D, FAN H J, LIU X Q, WAN Q, WU X H, LIU P, TANG J Z. Simultaneous extraction and purification of alkaloids fromAit. by microwave-assisted aqueous two-phase extraction with ethanol/ammonia sulfate system. Separation and Purification Technology, 2015, 141: 113-123.

[21] ZHANG W, LIU X Q, FAN H J, ZHU D, WU X H, HUANG X W, JAMES T. Separation and purification of alkaloids fromAit.by focused microwave-assisted aqueous two-phase extraction coupled with reversed micellar extraction. Industrial Crops and Products, 2016(86): 231-238.

[22] ZHENG X Z, XU X W, LIU C H, SUN Y, LIN Z, LIU H J. Extraction characteristics and optimal parameters of anthocyanin from blueberry powder under microwave-assisted extraction conditions. Separation and Purification Technology, 2013, 104: 17-25.

[23] ARYANTI N, WARDHANI H D, WASI A, RAMADHAN G A, PURBASARI A. Extraction characteristics of anthocyanin from roselle (L.) calyces by ultrasound-assisted extraction. Advanced Science Letters, 2017, 23(6): 5626-5628.

[24] 郭杰, 陶蕾, 王吉鴻, 王瑞雪. 響應面試驗優化超聲波輔助雙水相提取蕨麻多糖. 食品與發酵工業, 2021, 47(14): 151-159.

GUO J, TAO L, WANG J H, WANG R X. Optimization of ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction of polysaccharides fromL. using response surface methodology. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(14): 151-159. (in Chinese)

[25] 張喜峰, 楊春慧, 羅光宏. 乙醇/硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮. 食品與發酵工業, 2013, 39(10): 254-258.

ZHANG X F, YANG C H, LUO G H. Seperation and purification of total flabonids of grape seedswith ethanol/amonium sulphate aqueous two-phase system. Food and Fermentation Industries, 2013, 39(10): 254-258. (in Chinese)

[26] BENDAHOU A, DUFRESNE A, KADDAMI H, HABIBI Y. Isolation and structural characterization of hemicelluloses from palm ofL..Carbohydrate Polymers, 2006, 68(3): 601-608.

[27] 盧鵬飛, 高志強, 孫敏, 趙劍敏, 董石峰, 白雪, 尹璐, 侯非凡, 尹雪斌. 響應面法優化超聲波輔助提取黑小麥花色苷的工藝研究. 食品研究與開發, 2020, 41(4): 69-76.

LU P F, GAO Z Q, SUN M, ZHAO J M, DONG S F, BAI X, YIN L, HOU F F, YIN X B. Optimization of ultrasonic assisted extraction of anthocyanins from black wheat by response surface methodology. Food Research and Development, 2020, 41(4): 69-76. (in Chinese)

[28] 薛宏坤, 劉成海, 劉釵, 徐浩, 秦慶雨, 沈柳楊, 鄭先哲. 響應面法和遺傳算法-神經網絡模型優化微波萃取藍莓中花青素工藝. 食品科學, 2018, 39(16): 280-288.

XUE H K, LIU C H, LIU C, XU H, QIN Q Y, SHEN L Y, ZHENG X Z. A comparative study of the optimization of microwave extraction of anthocyanins from blueberry by response surface methodology and genetic algorithm-artificial neural network. Food Science, 2018, 39(16): 280-288. (in Chinese)

[29] 郭樹琴, 吳勝舉, 牛春玲, 劉亞慧, 李岱. 超聲提取綠茶茶多酚研究. 陜西師范大學學報(自然科學版), 2009, 37(1): 36-38.

GUO S Q, WU S J, NIU C L, LIU Y H, LI D. Study on extraction process of tea-polyphenols substance from green tee by ultrasound wave. Journal of Shaanxi Normal University (Natural Science Edition), 2009, 37(1): 36-38. (in Chinese)

[30] 謝雨婷, 李明智, 蔣海偉, 鄭時蓮, 鄧澤元, 李紅艷. 超聲波輔助提取紫茄皮花色苷工藝及其穩定性研究. 食品工業, 2015, 36(11): 43-48.

XIE Y T, LI M Z, JIANG H W, ZHENG S L, DENG Z Y, LI H Y. Response surface methodology for optimization of ultrasonic-assisted extraction and the stability of anthocyanins from eggplant-peel. The Food Industry, 2015, 36(11): 43-48. (in Chinese)

[31] 張黎明, 徐瑋. 超聲波輔助薯蕷總皂苷苷鍵裂解工藝研究. 天然產物研究與開發, 2007, 19(2): 286-289.

ZHANG L M, XU W. Research on ultrasonic cracking glycoside bond of dioscin frommakino. Natural Product Research and Development, 2007, 19(2): 286-289. (in Chinese)

[32] 于海鑫, 張秀玲, 高詩涵, 吳國美. 紫蘇葉花色苷微波輔助提取工藝優化及其抗氧化活性. 食品工業, 2019(10): 51-55.

YU H X, ZHANG X L, GAO S H, WU G M. Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanin from peril a leaves and its antioxidant activity. The Food Industry, 2019(10): 51-55. (in Chinese)

[33] 張團結. 油茶籽粕中茶皂素提取及純化工藝研究[D]. 南昌: 江西理工大學, 2016.

ZHANG T J. Study on extraction and purification technology of tea saponin fromseed meal [D]. Nanchang: Jiangxi University of Science and Technology, 2016. (in Chinese)

[34] LI P C, XUE H K, XIAO M, TANG J T, YU H S, SU Y Q, CAI X. Ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction and properties of water-soluble polysaccharides from malus hupehensis. Molecules, 2021, 26(8): 2213.

[35] SHAKER H S, BAGHBANBASHI M, AHSAIE F G, PAZUKI G. Study of curcumin partitioning in polymer-salt aqueous two phase systems. Journal of Molecular Liquids, 2020, 303: 112629.

[36] NG H S, KEE P E, YIM H S, TAN J S, CHOW Y H, LAN J C W. Characterization of alcohol/salt aqueous two-phase system for optimal separation of Gallic acids. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2021, 131(5): 537-542.

[37] JIANG B, WANG L L, ZHU M H, WU S, WANG X J, LI D M, LIU C H, FENG Z B, TIAN B. Separation, structural characteristics and biological activity of lactic acid bacteria exopolysaccharides separated by aqueous two-phase system. LWT, 2021, 147: 111617.

[38] 高曉燕. 幾種天然產物的雙水相體系萃取研究[D]. 徐州: 中國礦業大學, 2019.

GAO X Y. Study on extraction of several natural products by aqueous two-phase system [D]. Xuzhou: China University of Mining and Technology, 2019.

[39] JONG W Y L, SHOW P L, LING T C, TAN Y S. Recovery of lignin peroxidase from submerged liquid fermentation of amauroderma rugosum (Blume & T. Nees) torrend using polyethylene glycol/salt aqueous two-phase system. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2017, 124(1): 91-98.

[40] 辜鵬. 無機鹽/低分子有機物雙水相體系的研究及其應用[D]. 湘潭: 湘潭大學, 2008.

GU P. Study on inorganic salt and low molecular weight organnics formed aqueous two-phase system and its applications [D]. Xiangtan: Xiangtan University, 2008. (in Chinese)

[41] 李洋. 微波-超聲耦合雙水相提取、樹脂純化茶多酚工藝研究[D]. 贛州: 江西理工大學, 2018.

LI Y. Extraction and purification of tea polyphenols by an aqueous two-phase system combined with microwave-ultrasoni [D]. Ganzhou: Jiangxi University of Science and Technology, 2018. (in Chinese)

Optimization and Mechanism of Ultrasonic-Assisted Two-Phase Extraction of Tea Saponin

1Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;2College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640;3Guangdong Xinghui Biological Technology Co., Ltd., Longchuan 517323, Guangdong

【】Tea saponin is a naturally active substance with wide application prospective, and its purity is the key factor limiting its application and value. In this study, the optimal conditions for ultrasonic-assisted two-phase extraction (UAATPE) of tea saponin from camellia meal were explored, and the possible extraction mechanism was discussed in order to develop an efficient, high-purity extraction technology, so as to provide a technical guidance for high-value utilization of camellia meal. 【】On the basis of the single factor experimental results, the key factors affecting the yield of tea saponin were screened by Plackett Burman design, and the extraction process was optimized by Box-Behnken design. The extraction efficiency of tea saponin using the UAATPE method was evaluated by comparing the extraction yield and purity to the traditional ethanol extraction method and water extraction method. Scanning electron microscopy (SEM) was employed to analyze the microstructure of camellia meal, and the possible mechanism of extraction by the UAATPE method was discussed. 【】The key factors affecting the yield of tea saponin were mass fraction of ethanol, mass fraction of ammonium sulfate, and ultrasonic time. The process parameters optimized by Box-Behnken design were as follows: an ethanol content of 27.50% (W/W), an ammonium sulfate content of 19.60% (W/W), a liquid-solid ratio of 50﹕1, an ultrasonic time of 32 min, an ultrasonic power of 300 W and an extraction temperature of 60℃, and the yield of tea saponin at (26.21±0.54)% was achieved under the optimized conditions. Compared with the traditional method of ethanol extraction, the purity of tea saponin extracted by the UAATPE method increased by 6.57% (＜0.05), although the difference of the yield of tea saponin extracted by these two methods was not significant. Compared with the traditional method of water extraction, the yield and purity of tea saponin extracted using the UAATPE method were increased by 17.74% and 40.23%, respectively (＜0.01). The microstructure showed that owing to the effect of the camellia meal treated by the UAATPE method, the ultrasonic cavitation accelerated the tissue damage of the camellia meal, producing a large number of voids and strong surface shrinkage, which effectively promoted the release of tea saponin in the camellia meal. In the process of the UAATPE extraction, the tea saponin first entered the bottom phase with high electrical conductivity through solid-liquid extraction in the two-phase water system, and then moved to the top phase with high polarity through liquid-liquid extraction, achieving primary purification and improving the purity of tea saponin. 【】The UAATPE method could significantly improve the yield and purity of tea saponin, thus providing a new novel method for the efficient utilization of camellia meal.

camellia meal; tea saponin; ultrasound; aqueous two-phase extraction; Plackett-Burman; response surface design

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.014

2021-05-26；

2021-09-13

廣東省本土創新創業團隊項目（2019BT02N112）、廣東省現代農業產業技術體系創新團隊建設專項資金（2020KJ117）、廣東省農業科學院農業優勢產業學科團隊建設項目（202108TD）

杜金婷，E-mail：3046023329@qq.com。通信作者張雁，E-mail：zhang__yan_@126.com

（責任編輯 趙伶俐）