HPLC法測(cè)定番茄紅素膠束中番茄紅素Z/E異構(gòu)體含量

馬雪紅，劉婷，李傳天，朱金芳

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】番茄紅素（Lycopene）廣泛存在于自然界的各種植物中，成熟的紅色植物（番茄、西瓜等）果實(shí)中含量較高，屬于異戊二烯類化合物[1]。新疆溫差大、日照長(zhǎng)、降雨量少，生產(chǎn)的番茄含番茄紅素量高[2]。近年來(lái)，番茄紅素因具有降低多種慢性非傳染性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)而引起廣泛關(guān)注[3-10]。【前人研究進(jìn)展】番茄紅素分子中含有11個(gè)共軛以及兩個(gè)非共軛碳碳雙鍵。由于其分子結(jié)果高度的不飽和性，使其存在多種幾何異構(gòu)體，理論上存在211即2 048種立體異構(gòu)體，但由于分子鏈上的甲基位阻效應(yīng)，很大程度上限制了重排的數(shù)目，實(shí)際的異構(gòu)體數(shù)量要小得多，番茄紅素只存在72種異構(gòu)體，而現(xiàn)實(shí)中能檢測(cè)到的主要異構(gòu)體有：全反式（all-E）和單-順異構(gòu)體即（5Z）、（9Z）、（13Z）及（15Z）番茄紅素等幾種[11，12]。【本研究切入點(diǎn)】番茄紅素存在不溶于水、易發(fā)生順?lè)串悩?gòu)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定性差等問(wèn)題[13-15]，且人體攝入的天然番茄紅素的生物利用度低（約為10%～30%）[16]。需采用HPLC法測(cè)定番茄紅素膠束中番茄紅素Z/E異構(gòu)體含量。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將脂溶性的番茄紅素包載于牛血清白蛋白載體中，形成水溶性的納米膠束，以提高番茄紅素的穩(wěn)定性，增加其水溶性；采用手性柱簡(jiǎn)化異構(gòu)體洗脫方法，使番茄紅素各異構(gòu)體得到良好分離。采用HPLC法測(cè)定番茄紅素膠束中Z/E異構(gòu)體含量，為番茄紅素膠束的質(zhì)量控制及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

全反式番茄紅素對(duì)照品（039M4100V，Sigma，純度99.5%）。

番茄紅素膠束、空白膠束（實(shí)驗(yàn)室自制）；乙腈，甲醇，甲基叔丁基醚，為色譜純，其他試劑均為分析純。

TG16-W微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心儀器有限公司）；LC-16高效液相色譜儀（日本島津，PDA檢測(cè)器）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA-124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Carotenoid S-5（4.6×250 mm）；流動(dòng)相A：乙腈B：甲基叔丁基醚；線性梯度洗脫B在15 min內(nèi)由0%增加至50%，15～25 min內(nèi)B由50%增加至60%，25～35 min內(nèi)B由60%增加至65%，35～40 min內(nèi)B由65%減少至0%；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：472 nm；PDA檢測(cè)器光譜收集范圍：200～800 nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。

1.2.2 全反式番茄紅素對(duì)照品溶液的配制

制備109.45μg/mL的番茄紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中加丙酮定容，即得濃度為10.945μg/mL的全反式番茄紅素對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

將番茄紅素膠束溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，精密吸取過(guò)濾后的番茄紅素膠束溶液100μL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL三氯甲烷充分振搖溶解番茄紅素和膠束材料，再加入丙酮破乳定容，13 000 r/min離心15 min，取上清液即得。

空白膠束溶液配制方法同供試品溶液。

1.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液適量，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。圖1

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取全反式番茄紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液20、60、150、200、350、600μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用丙酮為稀釋劑配制成濃度分別為0.22、0.66、1.64、2.19、3.83和6.57μg/mL的全反式番茄紅素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以對(duì)照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，全反式番茄紅素峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取取番茄紅素對(duì)照品溶液6份，按1.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)測(cè)定并記錄全反式番茄紅素的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取番茄紅素膠束溶液100μL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL三氯甲烷充分振搖，再加入丙酮定容，于0、1、2、4、6、8、12、24 h按1.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD值。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同濃度的番茄紅素膠束溶液6份，每份100μL，按1.2.3項(xiàng)制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD值。

1.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取相同濃度的番茄紅素膠束溶液9份，每份100μL，分別加入適量番茄紅素對(duì)照品溶液，按1.2.3項(xiàng)制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

1.2.10 樣品含量測(cè)定

取三批番茄紅素膠束按1.2.3項(xiàng)配制供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，每批樣品測(cè)定3次，按公式（1）計(jì)算番茄紅素膠束中全反式番茄紅素的含量。

式中，C為全反式番茄紅素濃度（μg/mL），由峰面積代入標(biāo)曲計(jì)算得出；D為稀釋倍數(shù)，此處番茄紅素膠束的稀釋倍數(shù)為100倍。

1.2.11 番茄紅素異構(gòu)體的鑒別及含量計(jì)算

參考文獻(xiàn)方法[17，18]，利用PDA檢測(cè)器從以上供試品HPLC色譜圖中提取各組分峰最高點(diǎn)處的全波長(zhǎng)光譜圖，鑒別番茄紅素異構(gòu)體并截取300～600 nm的特征區(qū)域。根據(jù)其光譜信息計(jì)算Q值，即在361～362 nm處出現(xiàn)的順式特征吸收峰與最大吸收波長(zhǎng)的主吸收峰472 nm吸光度的比值，再結(jié)合特征吸收峰位置及單峰保留時(shí)間鑒別番茄紅素異構(gòu)體。以保留時(shí)間定性，待測(cè)溶液峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較定量。采用峰面積歸一化法計(jì)算番茄紅素異構(gòu)體的含量。

順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素與全反式番茄紅素相比，其紫外-可見(jiàn)光譜圖會(huì)向短波長(zhǎng)方向紫移，且摩爾吸收系數(shù)減小[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

研究表明，溶劑空白和空白膠束對(duì)照溶液對(duì)番茄紅素的測(cè)定無(wú)干擾，且番茄紅素膠束供試品中全反式番茄紅素的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液色譜圖一致，且與相鄰峰完全分離（R=1.647），理論塔板數(shù)＞5 000，符合要求。圖1

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜Fig.1 System suitability test HPLC pattern

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

研究表明，回歸方程為y=14 629x+1 221.1，r=0.999 6。全反式番茄紅素在0.22～6.57μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。圖2

圖2 全反式番茄紅素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of all-trans lycopene reference substance

2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率

研究表明，進(jìn)樣6次，平均峰面積33 652，全反式番茄紅素峰面積的RSD為0.73%（n=6），儀器精密度良好。

番茄紅素膠束含量的RSD為0.69%（n=8），供試品中番茄紅素在常溫放置24 h基本穩(wěn)定。表1

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=8）Table 1 Stabilitytest results（n=8）

進(jìn)樣6次，平均含量370μg/mL，番茄紅素膠束含量的RSD為0.73%（n=6），所用測(cè)定方法重復(fù)性好。

番茄紅素膠束平均加樣回收率為100.06%，RSD為1.99%（n=9），回收率良好，方法準(zhǔn)確度較高。表2

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 2 Sample recovery test（n=9）

2.4 三批樣品含量測(cè)定

研究表明，3批樣品重復(fù)測(cè)定3次批內(nèi)RSD值均小于1%，該方法重復(fù)性較好；不同批次樣品批間RSD值為0.54%，樣品制備工藝穩(wěn)定，批間含量差異較小。表3

表3 番茄紅素膠束含量測(cè)定（n=9）Table 3 Determination of lycopene micelles（n=9）

2.5 番茄紅素異構(gòu)體的鑒別

研究表明，4個(gè)峰的紫外-可見(jiàn)光譜在波長(zhǎng)為400～600 nm區(qū)段的峰形與全反式番茄紅素相似，峰位稍有移動(dòng)，都在470 nm左右有最強(qiáng)吸收峰，而順式番茄紅素分子不僅在472 nm左右處出現(xiàn)“山字”峰形的主吸收峰，且在360～362 nm處還會(huì)有一個(gè)明顯的特征吸收峰，番茄紅素膠束的異構(gòu)體為：1號(hào)峰13Z，2號(hào)峰9Z，3號(hào)峰All-E，4號(hào)峰5Z。表4，圖3～5

圖3 番茄紅素膠束的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogramsof lycopene micelles

圖4 全反式番茄紅素對(duì)照品的UV-Vis圖譜Fig.4 UV-Vis image of all-trans lycopene standard

表4 番茄紅素順?lè)串悩?gòu)體的鑒定Table 4 Identification of cis-trans isomers of lycopene

圖5 峰1-4的UV-Vis圖譜Fig.5 UV-Vis spectrum of Peak 1-4

2.6 番茄紅素膠束中異構(gòu)體含量計(jì)算

研究表明，制備所得的番茄紅素膠束中包含全反式番茄紅素和三種順式異構(gòu)體，順式異構(gòu)體中含量最多的為13Z，其次為5Z，含量最少的為9Z。表5

表5 番茄紅素順?lè)串悩?gòu)體的鑒定Table 5 The proportion of isomers in lycopene micelles

3 討論

3.1 異構(gòu)體鑒別

研究番茄紅素異構(gòu)體的鑒別結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20，21]。采用吸收峰的UV-Vis光譜圖“山字峰”的特征及Q值對(duì)其異構(gòu)體進(jìn)行鑒別[17-18，22]。實(shí)驗(yàn)的Q值（360～362 nm范圍的最大吸收值與459～476 nm范圍的最大吸收值的比值）通過(guò)與已發(fā)表的文獻(xiàn)比較[21，23]。3種單順式異構(gòu)體也是人體血清和組織中番茄紅素的主要存在形式[24，25]。順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素與全反式番茄紅素相比，其紫外-可見(jiàn)光譜圖會(huì)向短波長(zhǎng)方向紫移，且摩爾吸收系數(shù)減小[21]。順式番茄紅素分子不僅在472 nm左右處出現(xiàn)“山字”峰形的主吸收峰，且在360～362 nm處還會(huì)有一個(gè)明顯的特征吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21，22]。采用吸收峰的UV-Vis光譜圖“山字峰”的特征及Q值對(duì)其異構(gòu)體鑒別[17-18，23]。試驗(yàn)的Q值（360～362 nm最大吸收值與459～476 nm最大吸收值的比值）通過(guò)與文獻(xiàn)比較[19，20]，由于樣品處理方法的不同及HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相的差異，UV-Vis光譜圖中各異構(gòu)體的吸收峰及Q值與文獻(xiàn)報(bào)道略有差異，但不影響判斷。13Z，5Z，9Z這三種單順式異構(gòu)體也是人體血清和組織中番茄紅素的主要存在形式[24，25]。

3.2 流動(dòng)相體系的選擇

參考前人研究中番茄紅素異構(gòu)體的HPLC測(cè)定方法[29，30]，比較了乙腈∶甲基叔丁基醚=45∶55和乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚=37.5∶12.5∶50兩種不同的流動(dòng)相體系。以乙腈∶甲基叔丁基醚=45∶55為流動(dòng)相時(shí)，分離出4個(gè)異構(gòu)體，且峰面積和分離度較好；而以乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚=37.5∶12.5∶50為流動(dòng)相時(shí)，只分離出3個(gè)異構(gòu)體，峰面積較小，洗脫效果較差。實(shí)驗(yàn)采用乙腈和甲基叔丁基醚為流動(dòng)相。

3.3 溫度的選擇

分別比較了柱溫為30、35、40和45℃條件下各異構(gòu)體的分離度，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫的升高，保留時(shí)間逐漸提前，全反式番茄紅素的峰面積逐漸減小，且分離度變差，溫度的升高會(huì)加速番茄紅素的降解[31，32]，選擇30℃作為分析柱溫。

4 結(jié)論

建立了番茄紅素膠束中異構(gòu)體的含量測(cè)定方法，采用YMC Carotenoid S-5（4.6×250 mm）色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈B：甲基叔丁基醚；線性梯度洗脫；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：472 nm；柱溫：30℃，在45 min內(nèi)完成異構(gòu)體的分離檢測(cè)。該方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)；分離出了包括全反式番茄紅素在內(nèi)的4個(gè)異構(gòu)體，鑒定出了3個(gè)順式異構(gòu)體分別為13Z，9Z和5Z，測(cè)定了3批番茄紅素膠束中各異構(gòu)體的含量。