牛源無乳鏈球菌耐藥性與毒力基因的表達量差異分析

范 雪，邵 偉，趙艷坤，杜曉慧，陳 賀，王富蘭，王 帥

（1.新疆農業大學動物科學學院/新疆肉乳用草食動物營養實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室/新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】奶牛養殖環境、牛體本身以及致病菌之間的相互作用是導致奶牛乳房炎的主要致病菌，引起奶牛乳房炎的原因有很多，擠奶時工人手上攜帶的細菌以及臥床墊料等都可能引起奶牛乳房炎。無乳鏈球菌是一類人畜共患性病原菌，作為奶牛乳房炎的主要致病菌，能引起奶牛急性慢性的乳房炎，造成奶牛乳區出血等癥狀。【前人研究進展】無乳鏈球菌是一類條件性致病菌，致病性廣泛，可通過體表創傷以及口腔等途徑感染動物機體[1]。無乳鏈球菌在侵入動物機體后，可逃避宿主細胞的吞噬作用而大量繁殖，從而造成動物機體發病。無乳鏈球菌的致病性因毒力因子在表達上的不同而表現出差異性。無乳鏈球菌可憑借自身的毒力和致病性來侵襲寄主的組織，并在組織中生長繁殖。無乳鏈球菌的毒力因子主要有β-溶血素、CAMP因子、莢膜多糖等致病因子?！颈狙芯壳腥朦c】無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一。近年來，由于生產生活中對奶牛乳房炎的治療致使無乳鏈球菌產生了一定的耐藥性及多重耐藥現象。目前無乳鏈球菌對抗菌藥物的耐藥性及多重耐藥情況日較嚴重?！緮M解決的關鍵問題】對檢測無乳鏈球菌中的一些耐藥基因及毒力基因，并且對不同無乳鏈球菌菌株的毒力基因的表達量進行差異分析，為無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎篩選出合適的抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株除質控菌株為購買的編號為ATCC12386，其他均由前期對患奶牛乳房炎牛乳中經過培養、生化鑒定及16SrDNA比對分離鑒定所得，菌株由新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所保存。

1.1.2 主要試劑

16種抗菌藥物藥敏板購買自天津市金章科技發展有限公司，試驗所需哥倫比亞血平板均購自泰州木凡生物科技有限公司，胰蛋白胨大豆肉湯購自北京陸橋技術有限責任公司。DNA Maker DL2000及2×PowerTapPCR MasterMix均為百泰克生物技術股份有限公司產品。細菌基因組提取試劑盒為天根公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測

所用無乳鏈球菌菌株在哥倫比亞血平板上培養18～24 h復蘇純化，后在胰蛋白胨大豆肉湯進行增菌，采用微量肉湯稀釋培養的方法進行藥敏試驗。

1.2.2 毒力基因與耐藥基因的PCR檢測

所采用的毒力基因引物參照[2-3]的方法進行設計，耐藥基因參照[4-6]的方法設計，引物均有北京鼎峰生物技術股份有限公司合成。反應體系為30μL：2×PowerTapPCR MasterMix 15 uL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，ddH2O補齊至30μL。表1

表1 無乳鏈球菌毒力基因與耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of virulence gene and drug resistance gene of Streptococcusagalactiae

1.2.3 無乳鏈球菌8種毒力基因的熒光定量檢測

細菌RNA提取先用20 mg/mL的溶菌酶處理，后用Trizol法進行RNA提取。反應體系為20μL：2×One Step SYBR Green Mix 10μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1μL，上下游引物各0.4μL，50×ROX reference Dye 1 0.4μL，模板DNA1μL，無RNA酶的ddH2O補至20μL。反應體系為逆轉錄（50℃，3 min），預變性（95℃，30 s），循環反應（95℃，10 s；60℃，30 s）×30，溶解曲線（95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s）。表2

表2 無乳鏈球菌毒力基因熒光定量引物序列Table 2 Sequence of fluorescent quantitative primers for virulence gene of Streptococcus agalactiae

1.3 數據處理

使用EXCEL對數據進行初步整理，之后利用SPSS統計軟件（22.0）對無乳鏈球菌毒力基因的表達量進行單因素方差分析，并進行Duncan多重比較，P＜0.05視為差異顯著。利用EXCEL繪制藥敏試驗柱狀圖、GraphPad Prism軟件（7.0）繪制基因表達量圖。

2 結果與分析

2.1 無乳鏈球菌抗菌藥物敏感性檢測

研究表明，牛源無乳鏈球菌對青霉素、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考、利福昔明、萬古霉素、環丙沙星、復方新諾明這11種藥物的敏感性達到了65%以上，其中敏感性最高的是氟苯尼考（92.4.%）和頭孢噻呋（88.4%）；無乳鏈球菌菌株對這16種藥物均存在不同程度的耐藥，無乳鏈球菌對氨芐西林、紅霉素、克林霉素的耐藥率均達到了50%以上，對磺胺異惡唑的耐藥率也達到了45%以上。圖1

圖1 牛源無乳鏈球菌耐藥性檢測結果Fig.1 Testing results of drug resistanceof Streptococcusagalactiae from cattle

多重耐藥情況多為2耐和4耐，多重耐藥率分別為23.1%和15.4%，多重耐藥最嚴重的是對這16種抗菌藥物均耐藥。奶牛乳房炎無乳鏈球菌均有多種耐藥情況，并且根據場間用藥不同，地區不同而有所差異。圖2

圖2 牛源無乳鏈球菌多重耐藥檢測結果Fig.2 Testing results of multi-drug resistance of Streptococcusagalactiae from cattle

2.2 無乳鏈球菌耐藥基因與毒力基因的檢測

研究表明，無乳鏈球菌對紅霉素、克林霉素及多西環素，氨芐西林這是4種抗菌藥物產生耐藥，并產生了多重耐藥現象，多集中于對2～5種藥物耐藥，甚至達到了對16種藥物都耐藥。sul1和gyrA的檢出率為100%，ermB檢出率為93.3%，ermC的檢出率為33.3%；而ermA、sul2、sul3及parC這4種耐藥基因未檢出。pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB的檢出率為100%，rib檢出率為13.3%，bca的檢出率為53.3%，cylE檢出率為73.3%；而bac、lmb、scpB這3種毒力基因未檢出。圖3，圖4

圖3 無乳鏈球菌毒力基因的凝膠電泳Fig.3 Gel electrophoresis of virulence gene of Streptococcusagalactiae

圖4 無乳鏈球菌耐藥基因的凝膠電泳Fig.4 Gel electrophoresis of drug resistance genes of Streptococcus agalactiae

2.3 無乳鏈球菌毒力基因的表達量差異

研究表明，野生菌株HLJ044和NM-038-2顯著高于質控菌株ATCC12386（P＜0.05）；在cspA基因中，NM-038-2的表達量顯著高于其它2株菌，HLJ044的表達量顯著高于質控菌株ATCC12386（P＜0.05）；在sip基因的表達量檢測結果中，HLJ044的表達量顯著高于其他2株菌，質控菌株ATCC12386又顯著高于NM-038-2（P＜0.05）；對于iagA基因，NM-038-2菌株的表達量顯著高于其他2株菌（P＜0.05）；對于pavA基因和hylB基因，NM-038-2菌株的表達量顯著高于其他2株菌（P＜0.05）；NM-038-2的表達量顯著高于其他2株菌，而ATCC12386菌株的表達量又顯著高于HLJ044菌株（P＜0.05）；在bibA基因的表達量檢測圖中，NM-038-2顯著高于其他兩株菌，HLJ044菌株的表達量又高于質控菌株ATCC12386（P＜0.05）。圖5

圖5 無乳鏈球菌不同菌株毒力基因的表達量Fig.5 Testing results of virulence genes expressions in different strains of Streptococcusagalactiae

3 討論

3.1 無乳鏈球菌耐藥性

抗菌藥物的用量與細菌耐藥性的形成存在著一定的關系，除了細菌自身耐藥性的變遷和藥物自身的特點之外，還可能與藥物種類、數量和藥物的用量相關[7-8]。大環內酯類藥物為抑菌劑，而β-內酰胺類為殺菌劑，可以先使用大環內酯類抗菌藥物抑制細菌的生物被膜的形成，采用β-內酰胺類藥物采用自身對細菌的殺菌效果，把細菌鏟除，達到相輔相成的效果[9]。

無乳鏈球菌常常定植于奶牛的乳腺中，雖然無乳鏈球菌的致病性不強，但其對奶牛乳腺組織造成傷害并使奶牛機體的免疫功能失衡。研究結果顯示，無乳鏈球菌對紅霉素、克林霉素，磺胺異惡唑及四環素耐藥，與多個文獻對于無乳鏈球菌的藥敏結果趨于一致[10-13]。可能與對于無乳鏈球菌引起的病癥采用同類藥物所造成有關。對于青霉素、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、頭孢噻吩等11種抗菌藥物的敏感性較高，此結果與鄧穎穎[14]的研究結果一致，但與劉嬋[15]、祝宇[5]等分離出的無乳鏈球菌對不同抗菌藥物表現出不同的耐藥性的結果有所不同，尤其是對青霉素、紅霉素等藥物的耐藥的結果不一致，可能是因為地區或菌株來源不同所采用的治療藥物也有所不同而導致。

3.2 無乳鏈球菌毒力基因與耐藥基因檢測

鞭毛、菌毛，生化因子等等都可以作為調節細菌的物理屬性[16-18]。pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB毒力基因的檢出率為100%，此研究結果與前人研究一致[19-20]；而對于rib檢出率為13.3%，bca的檢出率為53.3%，cylE檢出率為73.3%，3種毒力基因的檢出率均有所出入。而對于bac、lmb、scpB這3種毒力基因未檢出，這與Carvalho-Castro[21]等在巴西分離的菌株未檢出bac基因相符，與Duarte等[22]的檢出率為7.3%的結果有所不同，可能是由于無乳鏈球菌的來源不同而導致。

研究共檢測到了4種耐藥基因。與藥敏試驗結果基本相符合，并且試驗無乳鏈球菌菌株產生了同時攜帶4種耐藥基因的菌株。結果發現，對于氟喹諾酮類耐藥基因gyrA的檢出率為100%，而parC的檢出率為0%，與王愛媛[19]的研究結果不同，對于無乳鏈球菌攜帶ermB基因的檢測結果來看，與路璐等的研究結果有所差異，可能是由于各地對于細菌引起的奶牛乳房炎的用藥不同所導致。

3.3 無乳鏈球菌毒力基因的表達量差異

粘附與定植相關的纖維蛋白原結合蛋白，黏連蛋白，細菌免疫原性黏附素基因等等，與侵襲相關的β溶血素，CAMP因子，透明質酸鹽裂解酶等，與免疫逃避相關的莢膜合成及細胞壁相關因子，表面免疫原性蛋白，超氧化物歧化酶等等。蘇友祿等[23]的研究，結果顯示，蛋白缺失導致弱毒株的毒力變強，而強毒株的毒力明顯減弱，并且缺失蛋白菌株的毒力基因（sodA、cspD及cspG）在弱強菌株中的表達呈現出相反模式，但cspA和pavA基因的表達未受影響。Wang[24]的研究結果顯示，缺失hylB基因會導致可能導致無乳鏈球菌的存活能力降低，對宿主的毒力明顯減弱。

4 結論

無乳鏈球菌對紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，在實際生產過程中，場內在用藥前先做診斷，采用合適的抗菌藥物防止奶牛乳房炎。大多數毒力基因都有不同程度的檢出，但對于普通PCR和熒光定量PCR檢測較高的pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB這8個基因對無乳鏈球菌的致病性起著重要的作用。