UPLC-Q-TOF-MS法篩查牛乳中48種獸藥殘留

康俊杰，鄭百芹，項愛麗，李愛軍，董李學，湯學英

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農產品質量安全檢測技術創新中心（唐山 063000）

原料奶的安全問題，作為生產鏈的源頭面臨嚴峻的挑戰，其主要表現是生鮮牛乳中的獸藥殘留。人類長期進食獸殘超標的牛乳，會對身體造成不良影響，同時還會造成人體的耐藥性[1-4]。β-受體激動劑一直以來是豬肉中檢測的重點參數，但近兩年在唐山地區牛肉和牛尿中克倫特羅有檢出的現象。GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》和《中華人民共和國農業農村部公告 第250號》對獸藥殘留也做出了規定，考慮到養殖者用藥的不確定性和復雜性，建立一種包括β-受體激動劑的快速測定多種獸殘的檢測方法刻不容緩。

目前，牛乳中多種獸藥的快速檢測方法有微生物法[5]、毛細管電泳法[6]、酶聯免疫吸附法[7-8]、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法[9-10]、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS法）[11-14]。針對以上問題，試驗采用UPLC-Q-TOF-MS快速篩查生鮮牛乳中48種磺胺類、喹諾酮類、β-受體激動劑類、抗病毒類4類獸藥殘留，該方法具有前處理快速、靈敏度高、回收率穩定等優點，可用于牛奶樣品中目標獸藥的測定，為牛奶的快速篩查提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

X500R超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（美國SCIEX公司）；高速冷凍離心機（湖南cence湘儀產品）。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純，美國Merck公司）；甲酸銨（色譜純，美國Sigma公司）；Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱（美國Waters公司）；十八烷基硅烷（ODS C18，美國Agilent公司）；試驗用水為超純水（Millipore公司）。

標準品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、周效磺胺、磺胺二甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺二甲異唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹惡啉、磺胺醋酰、甲氧芐啶、磺胺苯吡唑、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、鹽酸地氟沙星、惡唑酸、氟甲喹、沙拉沙星、司帕沙星、丹諾沙星、氟羅沙星、馬波沙星、依諾沙星、奧比沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星、西諾沙星、萘啶酸、金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺、鹽酸美金剛、咪喹莫特、鹽酸嗎啉胍（病毒靈）、奧司他韋、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、特布他林，純度均≥98%，天津阿爾塔公司。

1.2 標準溶液配制

分別吸取1 mL上述標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成10 μg/mL的標準儲備液，于-20 ℃保存。試驗用1∶1甲醇水稀釋上述標準儲備液，配制成不同濃度的混合標準使用液，于4 ℃保存。

1.3 樣品預處理

取1.00 g生鮮牛乳，加入4 mL 0.2%甲酸乙腈，旋渦振蕩1 min，按10 000 r/min高速離心5 min，取上清液過Oasis PRIME HLB固相萃取柱。控制流速在1 s/滴，收集全部流出液，氮氣下吹干，用1 mL 5%甲醇水溶液定容，過0.22 μm濾膜后，上機測定。

1.4 色譜-質譜條件

液相色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3（21 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.300 mL/min；流動相A為水相體積分數0.1%甲酸水，流動相B為有機相10 mmol/L甲酸銨-甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，A為95%；0.5～1.00 min，A由95%線性降至70%；1.00～6.00 min，A由70%線性降至5%；再回到初始狀態保持3 min。

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子模式（ESI+），掃描范圍為m/z80～1 000 Da，毛細管電壓5.5 kV；鞘氣壓力50 psi，氣簾氣35，溫度500 ℃，輔助氣壓力50 psi，CAD氣7；去簇電壓80 V，碰撞能量10 V；為了保障質量數精度，用SEIEX公司提供ESI+溶液，對儀器質量軸進行質量校正，參比離子為m/z132.904 88，m/z266.159 81，m/z354.212 24和m/z442.264 67。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件優化

試驗選用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，考察了10 mmol/L甲酸銨-甲醇、10 mmol/L甲酸銨-乙腈、0.1%甲酸水、1%甲酸水、乙腈和甲醇6種流動相對48種獸藥的分離、離子化效率和峰型的影響。結果表明：當流動相不加酸或酸度較高時，目標化合物的響應值均偏小；當選用0.1%甲酸水時，目標化合物的峰分離較好，響應值增大，峰形好；而不加10 mmol/L甲酸銨的甲醇或乙腈的色譜峰明顯提前，分離效果較差。與乙腈相比，甲醇作為流動相可以獲得更好的分離度，所以試驗水相采用0.1%甲酸水，有機相采用10 mmol/L甲酸銨-甲醇作為流動相進行梯度洗脫，以實現目標化合物的有效分離。

2.2 質譜條件優化

根據國內近3年在牛肉、牛尿和牛奶樣品中獸藥殘留的檢出情況，最終確定48種常用獸藥。將目標化合物配制成質量濃度為100 ng/mL的混合標準溶液。應用超高效液相色譜儀進行色譜分離，Q-TOF進行質譜信息采集，在ESI+模式下，在m/z80～1 000范圍內作一級質譜全掃描分析，再在不同的碰撞電壓下，進行二級質譜掃描分析，收集48種目標化合物的保留時間、母離子精確分子質量等信息，以建立完整的48種獸藥的質譜篩查譜庫。譜庫中應包含化合物的名稱、保留時間等，具體分析參數見表1。試驗再通過比較各化合物的離子色譜峰的響應值和分離度，分別優化毛細管電壓、鞘氣壓力等質譜參數，48種獸藥的提取離子色譜圖見圖1，以磺胺噻唑為例，其一級質譜圖和二級質譜圖見圖2和圖3。

圖1 48種獸藥的混合標準溶液的總離子流色譜圖（正離子）

圖3 磺胺噻唑質譜掃描圖

表1 48種獸藥的質譜分析參數

2.3 樣品前處理方法的選擇

試驗比較不同提取溶劑，提取目標化合物，同時沉淀蛋白。試驗選擇體積分數1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、乙腈作為3種提取液。試驗表明當采用0.2%甲酸乙腈提取效果最好，酸化后乙腈的提取效果明顯高于純乙腈，但甲酸的體積分數太高，對堿性化合物回收率影響較大。因此試驗最終選擇0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑，與文獻[15]研究結果一致。48種獸藥化合物的回收率均在60%～120%之間，能滿足快速篩查試驗的基本要求。

試驗選取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB和C18這3種固相萃取柱進行比較試驗。結果表明，與Oasis HLB和C18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基質干擾，基質抑制改善明顯，目標化合物均有較高的回收率。同時試驗了Oasis PRIME HLB柱無活化和平衡過程，采用直接上樣品凈化方式，對目標化合物進行處理，結果表明，此固相萃取柱活化平衡步驟對此次試驗的化合物回收率影響不大，故選用Oasis PRIME HLB小柱進行凈化，以達到樣品中目標化合物快速篩查的目的。

2.4 方法學確證

2.4.1 標準曲線和定量限

取空白生鮮牛乳樣品，根據目標化合物在質譜中響應的強弱，加入不同濃度的混合標準溶液，按試驗方法進行樣品的預處理，對提取液中的目標化合物進行測定，以化合物的離子峰面積Y對其相應質量濃度X（μg/kg）做標準曲線，48種獸藥的線性范圍等見表2。各目標化合物的信噪比為10（S/N=10）的濃度，為其定量限（LOQ）。由圖2可看出，在10～500 μg/kg線性范圍內相關系數均大于0.99。查看牛奶中最大殘留限量（MRL）數值，該方法的LOQ數值小于MRL，能滿足快速篩查的試驗要求。

圖2 磺胺噻唑提取離子色譜圖

2.4.2 回收率和精密度

向空白牛乳中添加3個不同質量分數水平（10，20和50 μg/kg）的48種混合標準溶液，按1.3小節的方法進行提取，用UPLC-Q-TOF進行測定目標化合物。每一個添加濃度重復測定6次進行試驗，計算平均回收率和相對標準偏差（SRSD）。牛乳中48種獸藥的加標回收率為68.4%～118.2%，SRSD為3.1%～29.8%。

2.5 樣品分析

按試驗方法對唐山地區奶牛場現場采集到的50批生鮮牛乳樣品進行篩查檢測分析。結果測出一批牛乳樣品中磺胺間甲氧嘧啶有檢出，質量分數為85.4 μg/kg。為了驗證該結果，分別采用GB/T 21316—2017和GB/T 22966—2008液相質譜法進行驗證，檢測結果分別為83.9和81.6 μg/kg，3種試驗方法的檢測結果標準偏差在允許范圍內，進一步確證了該方法對牛乳樣品快速篩查結果的準確性。

3 結論

該驗建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜測定生鮮牛乳樣品中48種禁用和限用獸藥殘留的快速篩查方法。該方法前處理過程簡單、快速、通量大、準確性高。UPLC-Q-TOF質譜法在牛乳中獸藥殘留快速篩查檢測方面有明顯優勢，可一次分析出數百種不同目標化合物，在獸藥殘留篩查領域有很高研究價值。