抗凍蛋白研究進展及其在新型食品冷凍工藝中的應用

龔弋航

浙江大學生物系統工程與食品科學學院（杭州 310058）

食品冷凍是一個復雜的過程，其關鍵步驟是生成冰晶，冰晶是影響食品品質的重要因素[1]，其形態及分布都將影響冷凍的效率和冷凍食品的質量。在食品制冷過程中，控制冰的重結晶和水的相變是維持產品質量的2種最重要的方法[2]。傳統的冷凍采用-50～ -40 ℃的冷風直吹冷凍法，水分子聚集而成的冰晶在表面膨脹，破壞食材的細胞組織，因此在解凍時會出現“滲水現象”。大的冰晶還會導致乳狀液的破乳、泡沫結構的坍塌和凝膠結構的破壞。同時冷凍過程中還會產生濃縮效應，使得食品的顏色、氣味和品質均出現比較大的破壞。現階段人民對于高品質冷凍食品的物質需求，督促更多性能優良的新興冷凍工藝出現。抗凍蛋白作為重要的生物抗凍劑應運而生，被用于食品的生產、儲藏和運輸的全過程以提高冷凍食品的質量。該文根據抗凍蛋白的研究進展，結合其理化特性分析其在食品冷凍中的應用和發展前景，從而為新型食品冷凍工藝的發展提供新的可能。

1 抗凍蛋白概述

1.1 來源和研究進展

抗凍蛋白（antifreeze proteins）亦稱熱滯蛋白，是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱。最初在19世紀60年代由Devries首次從南極魚類的血液中發現[3]，后相繼在昆蟲、植物體內發現有類似功能的蛋白，第一次有報道的抗凍脂蛋白從莫拉菌株中分離出，證明AFPs普遍存在于魚類、植物、昆蟲、細菌和真菌中[4]。其中植物來源的抗凍蛋白的研究起步較晚，1992年Griffith等[5]在冬黑麥的葉子中發現AFPs，被研究的植物材料達40余種。

1.2 抗凍蛋白的特性

1.2.1 熱滯效應

由于冰點是固液相共存時的溫度，大多數溶液冰點和熔點基本相同。而AFPs能夠非依數性地降低溶液的冰點卻對熔點沒有影響，因此添加了抗凍蛋白的食品冰點會低于熔點，其冰點和熔點的差值稱為熱滯差值。AFPs的這種活性稱為熱滯活性[6]。

1.2.2 重結晶抑制效應

晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結晶的過程中，會發生冰晶之間的聚合以及冰晶形態的改變，從而對組織造成機械損傷。而抗凍蛋白具有重結晶抑制效應，添加AFPs可抑制溶液冰晶的再結晶現象，使小冰晶均勻分布。

1.2.3 修飾冰晶的生長形態

另外，AFPs對冰晶的生長修飾具有獨特作用，它可以在冰晶的表面與其結合改變冰晶的形態并抑制其生長。在低溫環境下，冰晶由于受到AFPs的影響，其生長形態發生改變，由正常冰晶的扁圓型生長為六角形棱錐。隨AFPs的濃度增加和作用時間的延長，冰晶的形態趨近針狀[7]。

2 抗凍蛋白在冷凍中的作用機理

2.1 冷凍中冰晶的形成

水凍結是一種常見現象，冰晶形成的過程由2個過程組成：核的形成和晶粒的生長[8]。在成核過程中，水分子結合形成有序的冰粒，這有助于水分子在顆粒表面排列成冰晶。在冰晶生長階段，通過有序添加更多的水分子來增加核粒子的大小。冰晶的形態對溫度和過飽和度表現出復雜的依賴性。冰晶的凍結速率、質量擴散、導熱和水分子聚集最終決定冰晶的形態多樣性。冰晶的最終形態取決于溶液的溶質、溫度和冰晶生長速率，并且在不同的冰晶表面上生長速率不同。冰晶在冷凍過程中還會發生變質。由于小冰晶具有較大的比表面積和較高的自由能，其尺寸將增加，形成大冰晶，即發生重結晶。重結晶包括小冰晶的融化、大冰晶的生長和冰晶的融合。重結晶的發生可能會導致細胞膜破裂、損壞并導致細胞損壞，從而使冷凍技術失去其最初的優勢[2，9]。

2.2 食品系統中的冰晶

在冷凍過程中，食物系統中的化學反應和微生物的生長大大減少，有利于食物的保存。但是，冷凍過程也涉及與物理和生化反應相關的細胞結構的破壞。其中，起主導作用的因素是冰晶的形成，隨之引起包括脂質氧化、內源性酶活化、蛋白質的變性和聚集等一系列問題。

根據水的純度，冰的成核有2種形式：異質成核或均質成核。均質成核通常發生在極純凈水系統中。但是，在非純凈的水系統中更容易發生異質成核[2]。因此在食品系統中，結冰通常以異質成核的方式進行。在非均相成核過程中，水分子在懸浮的表面膜、外來顆粒或成核劑上聚集成晶體[10]。在食品系統中，產品溫度下降到冰點時，原子開始形成冰核，這種冰核是平衡周圍水分子的微小晶體。只要冰核的形成是穩定的，就可能在冰核的固相和液相之間添加分子促進其生長。

冷凍儲存期間食物的物理變化主要表現為開裂、重結晶、水分流失和遷移；化學變化主要包括風味變差、脂質氧化、蛋白質變性以及維生素和色素的降解。其中冰晶對冷凍食品的損害主要包括機械損害、重結晶、低溫濃縮和凍傷。冰晶可以通過機械應力對細胞造成機械損傷，在冷凍儲存過程中對組織和細胞膜結構的破壞將導致食物質地的惡化。

2.3 抗凍蛋白的幾種作用機理假說

抗凍蛋白按照來源的不同，可大致分為魚類抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白和細菌抗凍蛋白。由于不同抗凍蛋白組成結構的差異，其抗凍機理也略有差別。

關于抗凍蛋白作用機理的研究大多集中在魚類抗凍蛋白，而關于植物和昆蟲蛋白作用機制不十分明確，以下是2種主要的抗凍蛋白與冰晶結合的學說。

2.3.1 吸附抑制學說

1977年Raymond等[11]提出的吸附抑制學說解釋了AFPs抑制冰晶增長的機理，這也是目前接受最為廣泛的抗凍蛋白作用學說。該學說認為，AFPs分子可以吸附在冰晶表面，與冰晶間的結合非常緊密，只有當冰晶融化時兩者才會分離。外層的水分子不能接觸到晶核，而被AFPs分子覆蓋的冰晶表面停止生長。

一般晶體生長的方向與晶體的表面垂直，如果有雜質吸附在冰晶生長的通道上，那必須有一個外力促使冰在雜質上生長，使得冰晶表面的曲率變大，表面張力的增大導致體系平衡狀態的改變，局部凝固點的下降導致整個體系冰點降低。因此，在“吸附抑制”學說中，抗凍蛋白的作用主要有抑制冰晶生長和降低冰點。

2.3.2 晶格匹配學說

“晶格匹配”模型由DeViles[12]在1983年提出。在“晶格匹配”模型中，冬季比目魚AFP-Ⅰ的兩親性α螺旋通過規律排布，突出螺旋外的Thr和Asx殘基，從而與冰晶棱面相結合。這一緊密的結合也使得水分子和冰晶直接難以直接接觸，冰晶的進一步生長受阻。

Knight等[13]對于該學說作出補充說明，將AFPs限制冰晶整體生長的作用歸結為“臺階固定”和“表面固定”，前者表現為冰晶a軸生長受阻，后者表現為蛋白盡可能鋪滿冰晶表面，并認為冰晶在生長中會形成新的表面，而冰晶伴隨著新表面的形成會不可逆吸附更多AFPs，直到冰晶體被完全不能生長的表面包圍。

除了上述2種學說外，還有“偶極子-偶極子”學說、氫原子結合模型、剛體能量學說等，分別從冰的晶體結構、微觀原子角度和能量最小化的角度闡述抗凍蛋白的作用機理。

3 在食品冷凍工業中的應用

抗凍蛋白對冰晶的抑制以及改善冷凍食品的營養價值和質量的作用引起了人們的興趣和關注，因此其在食品冷凍中具有廣闊的應用前景。

3.1 基因工程技術

通過抗凍蛋白基因工程，可使原本自身不含AFPs的動植物體內產生抗凍蛋白，從而增強其抗寒能力。這一技術可用于冷凍食品原料的預處理上。運用基因工程技術將AFPs的基因轉移到目標食品原料上，使之表達，從而增強其田間抗寒能力，提高采后貯藏加工特性[14]。

運用基因工程將異源高活性抗凍蛋白基因導入果蔬等食品中，可以改善速凍產品在解凍過程中常出現的汁液流汁、軟爛，失去原有形態的問題，提高速凍品質量。實驗表明[15]導入抗凍蛋白基因的轉基因番茄可以在-6 ℃生存幾個小時，且不發生形變。

在基因工程領域，目前只有魚類AFPs基因的結構、表達調控機制有了系統研究，因此一般認為只能通過魚類AFPs改變食品原料的抗凍性。但在賴先軍等[16]研究中，將黃粉蟲抗凍蛋白基因TmAFP導入植物基因表達質粒，經過農桿菌介導的遺傳轉化得到抗凍甘薯，證實轉昆蟲抗凍蛋白基因可增強甘薯抗凍能力。由此可見抗凍蛋白轉基因工程的基因來源在未來的研究中有望進一步擴大，不同物種適合何種來源的抗凍蛋白基因也是值得深入研究的方向。

3.2 冷凍添加劑

AFPs可以通過直接混合、浸泡、真空滲透等物理手段添加到食品中，減小冰晶形成和重結晶對冷凍食品質構的破壞，改善食品品質，延長貨架期，因此一直被認為是冷凍食品的天然抗凍劑。以下是一些常見的應用實例。

3.2.1 在冷凍乳制品中的應用

抗凍蛋白在食品中最成功的應用是添加到冷凍乳制品中。冰淇淋在加工和貯藏過程中易受升溫或溫度波動的影響，較大的冰晶尺寸和冰晶的重結晶會使冰淇淋質地粗糙，失去原有的細膩口感。實驗證明在冰淇淋中加入燕麥中提取的AFPs，能夠降低冷藏過程中溫度波動對冰淇淋質地的影響[17]。基于對AFPs對冰淇淋的冷凍保護作用的研究，AFPs可以用作冰淇淋的天然抗凍劑，通過改善冰淇淋的耐熔融性，提高其玻璃化轉變溫度，以減少由冷凍和溫度波動引起的變質，提高冷凍乳制品的穩定性。

3.2.2 在冷凍肉制品中的應用

研究發現將肉浸泡在AFPs溶液中凍藏后可以明顯減小冰晶的大小并減少由于冷凍引起的組織損傷。抗凍蛋白以一定的方式與肉組織結合，但在肉中的擴散需要一定時間。除了物理浸泡法，還可以通過在宰殺前對牛羊注射AFPs的方式改善冷凍肉品質。在不同時間宰殺的羔羊中靜脈注射從南極鱈魚分離的AFPs，在真空包裝后將肉樣品在-20 ℃下保存2～16周。結果表明，在屠宰前1～24 h進行AFPs注射可以減少冰晶的大小和解凍后的滲水現象[18]。

3.2.3 在冷凍面團中的應用

面筋蛋白的理化性質和網絡結構在冷凍過程中會被冰晶破壞，從而導致面團質量下降，而AFPs可用作冷凍面團的有益添加劑。抗凍蛋白對冷凍面團質地特性的影響研究表明，添加AFPs可以降低面團的結冰水含量[19]，從而使面團更加柔軟和穩定，顯著改善其發酵能力。此外，添加AFPs可以減弱凍融處理對水分流動性的影響，影響冷凍面團中水分分布并提高面團的保水能力[20]。

4 結語與展望

科學家已對AFPs在食品中應用的安全性和可行性進行評估，認為其本身既無毒性，其功能特性也不會產生任何顯著的毒理學作用，通過抑制冰晶的生長并減少冰的重結晶，AFPs被認為是提高冷凍食品營養價值和質量的自然選擇。但關于AFPs的研究大多還是停留在實驗室內，真正在食品生產領域還未得到廣泛應用，下面對限制其應用的主要原因進行總結：

1) 天然存在的抗凍蛋白數量有限，并且純化活生物體中AFPs的成本非常高。正如上文所提到的，關于抗凍蛋白的提取大多還是實驗室內的研究，相對來說提取規模比較小，應用的對象也存在一定的局限。如果要在食品生產中得到廣泛的應用，必須找到一種成本低、效率高的大規模提取方式，以實現生產效率和效益的雙收。

2) AFPs的添加不適用于標準的混合工藝，在諸如巴氏殺菌等需要加熱或溫度變化較大的工藝流程中，AFPs會由于變性變得不穩定。要實現抗凍蛋白在冷凍食品中的生產應用，必須要有一套完整合理、不會對其生理生化特性造成損害的工藝流程。因此，需要結合抗凍蛋白的特殊理化特性，進行工程技術和生產工藝方面的優化改進，與其相適配的新型生產技術有待出現。

3) 與大多數抗凍蛋白相似，通過基因工程制備的AFPs也面臨著低表達和活性喪失的問題。目前已商業化生產的有抗凍糖蛋白和冬季比目魚的I型抗凍蛋白，但主要還是用于研究領域。目前已知的抗凍蛋白在商業化食品中的生產應用為聯合利華的Breyers品牌的輕雙攪雪糕，作為食品和健康保健領域的巨頭，該企業已有含ISPs的產品出售，但其通過轉基因酵母菌生產的方式也令它面臨著一些爭議。

AFPs一直是近年來科研工作者所關心的領域，針對其在食品生產領域應用限制的原因，有以下主要方向值得進一步研究探索。

1) 基于AFPs在食品加工工藝流程中容易喪失活性的問題，可以進行新型AFPs的開發，如利用分子生物學手段進行AFPs的重組表達，并利用基因工程技術制備高活性重組抗凍蛋白。

2) 除了天然ADPs，在化學合成AFPs方面，也應當進一步研究其與食品體系中其他物質的作用，并完善相關的安全性評價。另外，通過探索AFPs的類似物和模擬物的合成工藝，有望實現抗凍蛋白替代品的生產。

3) AFPs的酶促修飾非常有前景，具有抗凍特性的產品可以通過用蛋白酶對明膠進行酶促修飾來獲得。例如利用木瓜蛋白酶修飾的膠原蛋白肽具有抗凍活性。需要通過進一步的研究，增加EMAFP的水平并加快其在冷凍食品中的進一步應用。

另外，如何提高AFPs的分離產率，降低其應用的成本也是亟待解決的問題。隨著對抗凍蛋白及其凍藏理論不斷的深入研究及新技術的不斷應用，AFPs將實現在商業化食品生產中得以廣泛應用，真正實現科技造福人類的生產方式。