魚(yú)類鮮度K值的HPLC-UV-MS/MS快速測(cè)定方法研究

張飛，周漪波，鄧遠(yuǎn)強(qiáng)，阮奇珺，付強(qiáng)，鄭家概

廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心（廣州 510070）

我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費(fèi)和貿(mào)易大國(guó)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)于魚(yú)肉的感官、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性的要求日益提高[1]。新鮮度是衡量魚(yú)肉及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，它直接決定產(chǎn)品的最終價(jià)值[2]。對(duì)于某些生食的魚(yú)肉產(chǎn)品，其新鮮度還是品質(zhì)和安全性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。新鮮的魚(yú)肉組織細(xì)嫩疏松、水分含量較高、內(nèi)源性蛋白酶豐富，即使在保鮮條件下，仍會(huì)發(fā)生一系列的變化，如三磷酸腺苷（ATP）降解、脂肪氧化、微生物滋生等[3-6]。活魚(yú)死后，呼吸作用停止，ATP停止合成，魚(yú)肉細(xì)胞中的ATP在酶的催化作用下依次降解為二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、肌苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）[7]。Saito等[8]將ATP降解鏈的末端產(chǎn)物（HxR和Hx）總和與ATP及其降解產(chǎn)物的總和的百分比定義為K值，K值可以量化評(píng)估魚(yú)肉早期的新鮮度[9]。ATP及其降解產(chǎn)物均為極性化合物，有的化合物結(jié)構(gòu)相似，同時(shí)分離比較困難，而且魚(yú)肉基質(zhì)復(fù)雜，容易受雜質(zhì)的干擾。目前測(cè)定K值的方法有高效液相色譜法、可視化嗅覺(jué)技術(shù)-HPLC法、濾紙電泳分析法和生物傳感器法等[10-13]。其中最常用的方法是高效液相色譜法，但是分離耗時(shí)較長(zhǎng)，ATP等化合物容易分解[14]，而且樣品基質(zhì)復(fù)雜，容易干擾目標(biāo)物。

針對(duì)ATP及其降解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和魚(yú)肉基質(zhì)的復(fù)雜性，試驗(yàn)建立了高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)快速測(cè)定ATP及其降解產(chǎn)物的分析方法，通過(guò)ATP及其降解產(chǎn)物的含量求得K值。將該方法用于魚(yú)肉中K值的測(cè)定，初步研究了儲(chǔ)存溫度對(duì)魚(yú)肉鮮度K值的影響規(guī)律，可為保鮮技術(shù)的研究提供數(shù)據(jù)支持，為其他水產(chǎn)品的K值測(cè)定提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290Ⅱ/6470A Triple Quard MS超高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent）；BT125D電子天平（德國(guó)Sartorius）；?T18 digital ULTRA-TURRAX?均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA）；FB15067型超聲波清洗器（美國(guó)Fisher brand）；甲醇（色譜純，Honeywell）；氫氧化鉀、鹽酸、高氯酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；甲酸、乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。此次研究用水均為一級(jí)水，試驗(yàn)所用活魚(yú)樣品為市場(chǎng)購(gòu)買。

三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、肌苷和次黃嘌呤（≥97%，Sigma）。10%高氯酸溶液和5%高氯酸溶液配制后密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量的ATP、ADP、HxR和IMP，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取適量的AMP和Hx于10 mL容量瓶，加2滴濃鹽酸，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用水將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合并逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為100，80，50，20，10，5.0和1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）/甲醇（1/9，V/V）。梯度洗脫：0～6 min，0% B；6～9 min，0% B～20% B；9～10 min，20% B；10～10.1 min，20% B～0% B；10.1～13 min，0% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

對(duì)乙酰氨基酚除了有液體劑型外，還有另外一種劑型——通過(guò)肛門給藥的栓劑。在國(guó)外，肛門給藥其實(shí)很普遍，但我國(guó)對(duì)于這種方式接受起來(lái)還比較困難。但對(duì)于有些情況，比如給寶寶喂藥時(shí)寶寶會(huì)嘔吐，或者夜里發(fā)高燒，不想把寶寶叫醒，這些時(shí)候肛門栓劑就會(huì)方便很多。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：安捷倫噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；掃描模式：正離子；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣（N2）溫度：350 ℃，流速：7.0 L/min；霧化氣（N2）壓力：40 psi；鞘流氣（N2）溫度：350 ℃，流速：11.0 L/min；毛細(xì)管入口端電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

預(yù)處理：將魚(yú)去頭尾、去鱗、去內(nèi)臟，清洗瀝干，去骨取魚(yú)肉切成魚(yú)片，粉碎均勻后備用。

前處理：稱取2.0 g（精確至0.1 mg）試樣于50 mL具塞離心管，加入20 mL 10%高氯酸提取劑，以10 000 r/min均質(zhì)1 min，超聲提取5 min，4 ℃下以8 000 r/min離心2 min，取出上清液。再取20 mL 5%高氯酸，清洗均質(zhì)器刀頭，洗液加到殘?jiān)小Ｖ貜?fù)上述操作，合并上清液，用水定容。取5 mL上述定容液至10 mL比色管，分別采用3.57 mol/L和1.79 mol/L的氫氧化鉀溶液將其pH調(diào)節(jié)至6.0～6.4，再用水定容至10 mL，過(guò)濾備用。注意：均質(zhì)和超聲均在冰水浴下進(jìn)行。

1.5 K值計(jì)算

參照相關(guān)文獻(xiàn)[8，10]按式（1）計(jì)算K值，單位為百分率。由式（1）可知K值越小，魚(yú)肉新鮮度越好。

式中：XATP，XADP，XAMP，XIMP，XHxR，XHx為樣品中ATP，ADP，AMP，IMP，HxR和Hx的含量，mmol/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，6種化合物在溶液中均以帶電離子形式存在，因此適用于電噴霧離子源進(jìn)行離子化。在電噴霧離子源的正、負(fù)離子模式下，分別對(duì)6種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描分析，結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)較好，信噪比較高，因此選擇正離子模式進(jìn)行測(cè)定，并同時(shí)確定了6種化合物的母離子質(zhì)荷比。通過(guò)碎片離子掃描分析，選擇豐度相對(duì)較高且穩(wěn)定的碎片離子為定性子離子。最后通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜模式的選擇

2.2.2 色譜柱的選擇

分別選用4種尺寸的C18柱進(jìn)行分離比對(duì)[17]：A柱Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm ×100 mm，2.7 μm）；B柱Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm ×150 mm，2.7 μm）；C柱Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；D柱Ultimate AQ-C18（2.1 mm ×150 mm，3.0 μm）。在同等流動(dòng)相條件下，B和D柱不能實(shí)現(xiàn)IMP，AMP和Hx的良好分離；A柱可實(shí)現(xiàn)6種化合物的分離，但色譜峰形較寬，拖尾嚴(yán)重；C柱既可實(shí)現(xiàn)基線分離，又可使色譜峰形良好，因此選擇C柱。

2.2.3 流動(dòng)相的選擇

在正離子模式下，流動(dòng)相中添加揮發(fā)性有機(jī)酸可以提高化合物的電離效率，增加質(zhì)譜響應(yīng)值，試驗(yàn)流動(dòng)相選擇添加甲酸[17]。在反相色譜中，常用的有機(jī)相為乙腈或甲醇。選擇乙腈，在梯度洗脫時(shí)產(chǎn)生的梯度鬼峰較多，因此選定甲醇作為有機(jī)相。

流動(dòng)相中甲酸和乙酸銨濃度的高低對(duì)6種化合物的保留時(shí)間和色譜峰形均有影響。通過(guò)考察不同甲酸和乙酸銨的濃度，最終確定了最佳流動(dòng)相條件：流動(dòng)相A含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液；流動(dòng)相B含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液/甲醇（1/9，V/V）。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序，6種化合物在13 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)良好分離，得到的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流和紫外色譜圖

2.3 樣品前處理

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行前處理優(yōu)化[10]。稱取預(yù)處理后的樣品，先進(jìn)行高速均質(zhì)，可以快速破壞魚(yú)肉細(xì)胞和組織，制得勻漿液，再利用超聲提取法充分提取目標(biāo)物。提取劑選用高氯酸溶液，既可以有效提取目標(biāo)物，又可以沉淀蛋白質(zhì)等化合物，減少基質(zhì)干擾。提取液的pH會(huì)影響ATP和ADP色譜峰形和保留時(shí)間，因此，需要調(diào)節(jié)提取液pH。提取的全過(guò)程保持低溫，以減緩ATD和ADP等化合物的降解。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)7個(gè)水平的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定。以6種化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，紫外色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，ATP和ADP在5.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其他4種在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)取樣量2.0 g，定容體積50 mL，稀釋一倍時(shí)，以3倍和10倍信噪比（S/N）分別計(jì)算方法的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

試驗(yàn)選擇石斑魚(yú)進(jìn)行測(cè)定，前處理方法參照1.4小節(jié)，ATP、Hx、AMP和HxR添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60～180 mg/kg時(shí)，回收率為71%～112%；ADP添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120～200 mg/kg時(shí)，回收率為73%～109%；IMP添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 200～2 000 mg/kg時(shí)，回收率為81%～107%。方法的準(zhǔn)確度可滿足試驗(yàn)要求。

平行制備6份供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中6種化合物的含量，計(jì)算求得6種化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果為8.5%～14.5%。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用該方法對(duì)石斑魚(yú)和紅魚(yú)的鮮度K值進(jìn)行測(cè)定，并探討在不同溫度下貯藏，魚(yú)肉的鮮度K值變化情況。得到的K值的變化規(guī)律見(jiàn)圖2。

由圖2可知：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種魚(yú)的K值均呈上升趨勢(shì)；貯藏溫度越高，兩種魚(yú)的K值上升速度越快；6 d后，（-2～2）℃冰晶溫度下貯藏的魚(yú)肉K值最高；魚(yú)的種類不同，初始K值不同，K值變化的快慢也不同。

圖2 -2～2 ℃，0 ℃和-18 ℃條件下K值變化

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了低溫提取-高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定魚(yú)類鮮度K值的分析方法。與現(xiàn)有方法相比[10]，該方法的色譜條件良好、分析時(shí)間短、回收率較高，質(zhì)譜條件可降低基質(zhì)干擾、定性準(zhǔn)確。該方法適用于魚(yú)肉中ATP及其降解產(chǎn)物的快速準(zhǔn)確定性和定量分析。試驗(yàn)存在不足之處：ATP和ADP色譜峰拖尾，引起信噪比降低，導(dǎo)致二者檢出限較高。ATP和ADP色譜峰拖尾的原因有：（1）二者均含有堿性氨基，易與固定相殘余的硅羥基發(fā)生作用；（2）儀器中的鋼組件表面涂有金屬氧化物，然而這些金屬氧化物的活性位點(diǎn)易與活性分子相結(jié)合。磷酸緩沖液流動(dòng)相可有效降低上述兩種作用力，然而磷酸鹽是不揮發(fā)鹽，不能用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。此外，質(zhì)譜分析只能用于定性，因?yàn)锳TP和ADP等化合物在質(zhì)譜電離過(guò)程中就會(huì)發(fā)生部分分解，因此采用質(zhì)譜定量不準(zhǔn)確。