高效液相色譜法同時測定嬰幼兒奶粉中7種水溶性維生素

張麗芳，張鑫，周鑫，張立田

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農產品質量安全檢測技術創新中心（唐山 063000）

維生素是維持人體正常生理功能的一類微量有機物質，分為脂溶性和水溶性兩大類。水溶性維生素主要有B族維生素和維生素C（VC），B族維生素包括：維生素B1（VB1）、維生素B2（VB2）、煙酸、泛酸、葉酸、生物素、維生素B6（VB6）和維生素B12（VB12）。它們是嬰兒奶粉的重要組成部分，在人體生長、代謝、發育過程中發揮著重要的作用。現行國標對水溶性維生素的檢測方法主要以單一維生素為主[1-6]，方法有微生物法和液相色譜法。微生物法檢測周期長、重復性差，偶然因素較多，不能同時檢測多種維生素。文獻報道多種維生素同時測定的方法，主要有液相色譜法[7-9]和液相色譜串聯質譜法[10-14]。液相色譜串聯質譜法具有靈敏性高、專一強等特點，但價格昂貴，儀器維護復雜，在基層實驗室比較難普及。高效液相色譜也具有較好的靈敏度和特異性，價格適中，分析成本低，適合在實驗室中廣泛推廣。

維生素物質間性質差異較大，而奶粉的基質又復雜，給維生素的同時測定帶來難度。劉娜等[8]通過在流動相中添加七氟丁酸，延長保留時間，提高分離度，建立嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜法，但方法中七氟丁酸的使用對環境存在危害。其他報道多以4～6種水溶性維生素同時測定較多。試驗以庚烷磺酸鈉代替七氟丁酸，優化色譜條件，建立嬰幼兒奶粉中7種水溶性維生素的高效液相色譜法，并對10批嬰幼兒配方奶粉中的水溶性維生素進行檢測。經方法驗證，該方法準確性高、重復性好，線性范圍寬，提高了檢測效率，可為監督部門的日常檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀（配SPD-M20A二級陣列管檢測器，島津）；酸度計（PHS-3E，雷磁儀電科學儀器）；電子天平（PL2002，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲儀（KQ-800KDB昆山市超聲儀器有限公司）。

VB1（100390-201806，含量97.9%），VB2（100369-201905，含量98.2%），煙酸（100434-201603，含量99.8%），煙酰胺（100115-202005，含量99.9%），葉酸（100074-201715，含量89.3%），VB6（100116-201906，含量99.9%），VC（100425-201508，含量100%），均購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸、氫氧化鈉、庚烷磺酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、醋酸、三乙胺（均為分析純，天津褔晨化學試劑廠）；甲醇（色譜純，德國merk）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別稱取適量的煙酸、煙酰胺和VB6標準品，分別用純化水配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。稱取適量的VB1標準品用濃度0.01 mol/L的鹽酸溶解后，用純化水制成0.5 mg/mL的標準儲備液。稱取適量的VB2標準品，用濃度2 mol/mL的鹽酸溶液溶解后，用純化水制成0.5 mg/mL的標準儲備液。稱取適量的葉酸標準品，用適量水潤濕，加入質量分數10%氨水溶液至完全溶解，用純化水制成0.1 mg/mL的標準儲備液。稱取VC標準品適量，用純化水制成10 mg/mL的標準儲備液。配制過程避光，儲備液置于4 ℃冰箱儲存。標準工作液在檢測前由儲備液用純化水配制成不同濃度。

1.2.2 樣品的制備

稱取待測樣品5.0 g（精確到0.01 g）于50 mL燒杯中，加入25 mL 50 ℃的溫水，混合均勻，超聲10 min，靜置放冷置室溫。然后用5 mol/L鹽酸調節試樣溶液的pH至1.7，放置2 min后，用2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節試樣溶液pH至4.5，混勻，用水定容至50 mL。以8 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.2 μm濾膜，上機待測。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱WondaSilTMC18（150 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相A：庚烷磺酸鈉1.1 g，醋酸25 mL，乙二胺四乙酸二鈉50 mg；三乙胺5 mL，用800 mL水溶解，調節pH至3.5，定容至1 000 mL。流動相B采用甲醇。流動相A∶流動相B= 85∶15。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

由于水溶性維生素屬于極性化合物，在反相色譜柱上保留比較弱，因此添加庚烷磺酸鈉作為離子對試劑，使水溶性維生素形成中性離子對，延長待測目標物的保留時間，增加分離度。嬰兒配方奶粉中多添加大量金屬元素，對色譜柱和色譜峰形都有影響，所以流動相中添加EDTA，降低影響。張憬等[15]研究發現，水溶性維生素檢測的流動相中三乙胺的添加可對峰形起到改善作用，經考察0.5%的三乙胺添加效果最好，與已報道的結果一致。

2.1.2 流動相pH的選擇

調節流動相pH可以抑制維生素的電離，調節保留時間，控制分離度。B族維生素在酸性條件性比較穩定，所以選擇pH 4.0，3.5和3.0這3種情況下進行比較試驗，結果pH 3.5和3.0時，標準物質的分離效果較好，但在pH 3.0時基質存在干擾，所以選擇pH 3.5。

2.1.3 流動相配比的選擇

比較甲醇的體積分數分別為20%，15%和10%時的分離效果，甲醇體積分數20%時，出峰時間較快，VC和煙酸不能完全分離；當甲醇體積分數為10%，維生素VB2的保留時間太長，甲醇體積分數15%時，各目標物在25 min內完全分離，且干擾小，最終確定甲醇的體積分數為15%。

2.1.4 檢測波長

將7種水溶性維生素分別在190～700 nm作紫外光譜掃描，得到各物質的最大吸收波長：VC、VB1、煙酸、煙酰胺為260 nm，VB2為267 nm，葉酸為281 nm、VB6為290 nm，利用二級陣列管檢測器，設定VC、VB1、VB2、煙酸、煙酰胺檢測波長為260 nm，葉酸、VB6檢測波長為280 nm。

優化后的色譜條件如1.2.3所示。在優化的色譜條件下，混合標準溶液的色譜圖如圖1所示。7種可溶性維生素分離情況較好。VC、煙酸、煙酰胺、VB6、葉酸、VB1和VB2的出峰時間分別為3.017，3.901，5.358，6.981，11.519，14.407和23.078。

圖1 色譜圖

2.2 前處理條件選擇

根據水溶性維生素的化學性質，采用50 ℃水溶解乳粉，超聲提取10 min，利用等電點沉淀法去除樣品中的蛋白質，樣品中加鹽酸溶解調節pH至1.7，放置2 min，再用氫氧化鈉溶解調節至pH 4.5。經反復試驗，此前處理過程回收率高，可滿足檢測需求。

2.3 線性范圍及檢出限

嬰幼兒奶粉中不同水溶性維生素的含量差異較大，根據嬰幼兒奶粉中各種水溶性維生素的大致濃度范圍，確定標準曲線的范圍。以3倍基線噪聲所對應的維生素濃度計算各種維生素的檢出限。結果表明，VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、VB6在0.1～10 μg/mL的質量濃度范圍內；葉酸在0.05～5 μg/mL質量濃度范圍內；VC在1～100 μg/mL質量濃度范圍內，均具有很好的線性關系，回歸系數r在0.999 60～0.999 90。除葉酸外，檢出限均達到或優于國家水平。7種水溶性維生素的線性范圍、相關系數和檢出限，見表1。

表1 維生素的線性方程和檢出限

葉酸的國標檢出限為0.001 mg/100 g，檢測方法為微生物方法，操作繁雜，對菌種活力、培養條件、人員操作水平等要求嚴格，檢測周期長，結果存在20%的不確定度[16]。該方法的檢出限雖高于國標要求，但可滿足嬰幼兒奶粉中國標限量的檢測要求，方法簡單，更適合推廣。

2.4 回收率與相對標準差

向已知濃度的奶粉樣品中分別添加3種濃度的各種水溶性維生素，每個水平重復試驗6次，通過加標回收的方式考察方法的準確度和精密度，結果見表2。加標回收率為94%～105%，相對標準偏差SRSD（n=6）為0.3%～2.1%，結果表明該方法準確、可靠，滿足定量分析的要求。

表2 奶粉中7種水溶性維生素在3個不同水平下的回收率和相對標準偏差（n=6）

2.5 實際樣品的測定

采用該方法對10批市售嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的含量進行測定，實測值、標示值以及實測值與標示值的比值，見表3。維生素實際測定含量均符合GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》[17]和GB 10767—2010《食品安全國家標準 較大嬰兒和幼兒配方奶粉》[18]。實測值與標示值比較，比值均大于80%，符合GB 13432—2013《食品安全國家標準 預包裝特殊膳食用食品標簽》[19]。

表3 實際樣品中水溶性維生素實測值與標準值的比對

接表3

3 結論

建立高效液相色譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、VB6、葉酸和VC的檢測方法。該方法的分析時間為25 min，線性關系良好（r＞0.999），檢出限在0.008～0.024 mg/100 g，3個水平添加回收率在94%～105%，SRSD為0.3%～2.1%。該方法簡單、快速、準確，靈敏度高，可用于嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素含量的同步測定。