鐵皮石斛中SOD提取純化及其在發(fā)酵食品中應(yīng)用

謝余嵐，張婷，姜夢(mèng)奇，羅靜靜，張珍林，

1. 皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院（六安 237012）；2. 植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心（六安 237012）；3. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室（六安 237012）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又稱黑節(jié)草，屬于蘭科，多年生附生型草本植物，主要分布于安徽、浙江、福州、廣西、四川、云南等地[1]。鐵皮石斛是一種珍稀中藥材，SOD是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基的清除劑，在機(jī)體內(nèi)催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧氣[2]，減少自由基對(duì)機(jī)體影響，具有抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)血脂和美容等功效[3-5]，研究發(fā)現(xiàn)在某些蔬菜和一些水果中含有較為豐富的SOD；含有SOD的水果和蔬菜的儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)于不含SOD的水果和蔬菜，食物中維生素C含量也有所增加，可以延長(zhǎng)食物的腐敗時(shí)間，因此有望將其應(yīng)用于易腐敗食品工業(yè)[6]。

在不同原料中，SOD提取的工藝方法有多種[7]，將提取的SOD進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用研究也有很多[8-9]。此次研究在以大別山產(chǎn)石斛為原料的基礎(chǔ)上結(jié)合查閱資料，用1年生鐵皮石斛為原料，采用較為簡(jiǎn)單的熱變性法進(jìn)行提取，用磷酸分級(jí)沉淀進(jìn)行提純，研究其在不同溫度下的活性，并將其應(yīng)用到發(fā)酵食品中，有助于提升不同生物中SOD的利用，擴(kuò)大SOD多方面用途的影響力，同時(shí)為研究石斛的多方面應(yīng)用價(jià)值、深入探索石斛在未來(lái)食品應(yīng)用方面的用途提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛；磷酸二氫鉀；磷酸氫二鉀；硫酸銨晶體；鄰苯三酚；自來(lái)水；純牛奶、酸奶（均為市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BS 200 S-WE 1）；水浴鍋（DK-S 24型）；勻漿機(jī)（JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)）；分光光度儀（UV-1600）；離心機(jī)（H-1850 R）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鐵皮石斛SOD的提取

試驗(yàn)中鐵皮石斛SOD采取熱變性法[10]進(jìn)行提取。采取1年生左右的鐵皮石斛，去除葉，留其莖，洗凈后用濾紙吸干水分，并將其直接粉碎，與水以2∶1的質(zhì)量比進(jìn)行勻漿，過濾之后60 ℃水浴20 min，用離心機(jī)以4 000 r/min離心20 min，取其上清液即得SOD粗品。

1.3.2 鐵皮石斛SOD的純化[11]

將硫酸銨結(jié)晶粉碎成白色粉末，緩慢定量加入SOD粗提物中，直至飽和至90%；放入冰箱30 min（4 ℃）；以4 ℃、4 000 r/min離心20 min，除去沉淀部分；向燒杯中加入硫酸銨粉末至其到達(dá)飽和度后，置于冰箱中30 min（4 ℃）；以4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集所得的沉淀。向沉淀中加入pH 7.8、5 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（PB），并搖晃。

1.3.3 鐵皮石斛SOD酶活性測(cè)定[12]

1.3.3.1 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定[13]

取用試管，按照表1的試劑劑量加入pH 8.00的KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液，將試管放置于25 ℃水溫的水中保溫10 min，加入50 mmol/L鄰苯三酚，搖勻后倒入1 cm比色皿中。在320 nm波長(zhǎng)下，4 min內(nèi)，每30 s測(cè)1次吸光度。

表1 測(cè)定鄰苯三酚自氧化速度加樣表

1.3.3.2 SOD酶活性的測(cè)定[14]

按表2的劑量測(cè)定SOD酶活性，加入上述樣品于樣品管中，加入鄰苯三酚。剩下步驟與1.3.3.1方法相同。根據(jù)吸光度，計(jì)算樣品液體自動(dòng)氧化率的變化，計(jì)算SOD酶活性。平行測(cè)定3份樣品。活力單位定義在1 mL反應(yīng)液中每分鐘控制鄰苯三酚自氧化速度達(dá)50%的酶量定義一個(gè)活力單位，即3.25 nm 0.030 A/min是1個(gè)動(dòng)態(tài)的單位，如果氧化率在35%～65%，可以按比例計(jì)算，超出這個(gè)數(shù)值范圍的試樣應(yīng)增加或減少樣液量。

表2 測(cè)定SOD酶活性加樣表 單位：mL

1.3.4 鐵皮石斛SOD最適溫度測(cè)定[15]

取上述提取的粗酶液20 ℃水浴10 min，根據(jù)鄰苯三酚自動(dòng)氧化體系，加鄰苯三酚測(cè)定酶活，分別采用30，40，50，60和70 ℃重復(fù)上述操作，比較SOD酶活力大小。

1.3.5 鐵皮石斛SOD在酸奶中應(yīng)用

取100 mL純牛奶，水浴加熱至42 ℃后加入15 mL乳酸菌，發(fā)酵4 h后放在4 ℃冰箱中，后發(fā)酵12 h，SOD分別在后發(fā)酵前加入和在發(fā)酵前加入，測(cè)定2種情況在后發(fā)酵結(jié)束后的0，12和24 h的SOD酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛SOD的提取

在SOD的提取過程中，有熱變性法和磷酸緩沖液2種方法，因?yàn)闊嶙冃苑梢钥刂茰囟纫约皶r(shí)間，對(duì)鐵皮石斛SOD提取具有精確的條件，操作簡(jiǎn)單，成本低廉且無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，故試驗(yàn)中鐵皮石斛SOD采取熱變性的方法進(jìn)行提取。提取的SOD酶活為8.72 U/mL。

2.2 鐵皮石斛SOD的純化[16]

用硫酸銨沉淀法對(duì)提取SOD粗酶液進(jìn)行純化，其酶活性顯著提高。如圖1所示。

由圖1可見，純化前SOD的酶活性為8.72 U/mL，純化后活性提高到10.22 U/mL，經(jīng)純化后的酶活性有顯著提高，考慮對(duì)后續(xù)試驗(yàn)提供更好幫助，提取后的酶均經(jīng)硫酸銨分級(jí)純化后進(jìn)一步進(jìn)行分析應(yīng)用。

圖1 SOD純化前后酶活性

2.3 鐵皮石斛SOD酶活性測(cè)定

用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定酶活，結(jié)果如圖2所示。在堿性環(huán)境下鄰苯三酚會(huì)被氧化，釋放氧氣并生成淡黃色中間產(chǎn)物，酶溶液的加入可抑制其自動(dòng)氧化速率。結(jié)果表明，相對(duì)于一般材料，鐵皮石斛SOD酶活性較高，有助于鐵皮石斛在醫(yī)藥學(xué)等方面發(fā)展，滿足抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體等方面的需求，為后續(xù)SOD酶活性研究奠定基礎(chǔ)。

圖2 酶活曲線

2.4 鐵皮石斛SOD最適溫度測(cè)定

將上述試驗(yàn)所制備的樣品進(jìn)行不同溫度的水浴，所得數(shù)據(jù)見圖3。

通過圖3分析試驗(yàn)中鐵皮石斛SOD酶活性最適溫度的測(cè)定結(jié)果，可以確定溫度能影響鐵皮石斛酶的活性。隨著溫度上升，在20～70 ℃時(shí)，酶活性不斷升高，前期變化較快，中期變化較慢，直至70 ℃，SOD酶活性達(dá)到最佳，且不會(huì)造成變性失活。故鐵皮石斛SOD酶活性最適反應(yīng)溫度為70 ℃。

圖3 不同溫度下SOD酶活性

2.5 鐵皮石斛SOD在酸奶中的應(yīng)用[17]

分別在牛奶發(fā)酵前、牛奶發(fā)酵后2種不同的發(fā)酵過程中添加SOD溶液，并在發(fā)酵結(jié)束后0，12和24 h檢測(cè)其活性。數(shù)據(jù)見表3。

表3 酸奶中鐵皮石斛SOD酶活性變化

結(jié)果表明：SOD在后發(fā)酵前添加，其酶活性高于在后發(fā)酵過程添加；經(jīng)過12和24 h發(fā)酵并測(cè)定酶活性，均顯示在發(fā)酵前加入會(huì)顯著提高其活性，而發(fā)酵24 h后酶活性值出現(xiàn)更加明顯的區(qū)別。在酸奶發(fā)酵前加入從鐵皮石斛中提取純化的SOD可使酸奶的活性上升，且在酸奶發(fā)酵前加入更有助于保持和提高酶活性。

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛自身具有極高的藥用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外有關(guān)鐵皮石斛活性成分含量探究較多，但有關(guān)于鐵皮石斛中SOD的提取純化及其應(yīng)用的研究卻很少。在試驗(yàn)過程中，將石斛提取出來(lái)，并進(jìn)行純化，測(cè)定酶活和其最適溫度時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70 ℃時(shí)鐵皮石斛的酶活最高。通過在酸奶中的應(yīng)用可以發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前加入鐵皮石斛中提取的樣品，其發(fā)揮的活性最高。此次試驗(yàn)以1年生鐵皮石斛為原料進(jìn)行SOD的提取及應(yīng)用研究，為大別山產(chǎn)鐵皮石斛價(jià)值的多樣性以及鐵皮石斛SOD資源的食品深開發(fā)利用提供重要參考依據(jù)和借鑒。