4個產地金柑抗氧化及抑制亞硝化活性研究

魏愛紅 ，張超，譚思云，郭鎣，林展雯張聲源 *

1. 嘉應學院，廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室（梅州 514015）；2. 嘉應學院醫學院，客家藥用生物資源研究所（梅州 514031）

機體在正常情況下，體內自由基的產生與清除處于動態平衡之中，使機體各項生理指標維持在正常水平。但機體處于病態下，平衡被打破，機體產生大量過剩的自由基[1]。活潑的自由基可與機體內多種生物大分子，如核酸、蛋白質、脂肪酸等發生作用，破壞相關細胞結構，導致細胞膜、遺傳因子嚴重損傷，進而誘發癌變、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病[2-3]。在眾多致癌物中，亞硝胺是世界公認的最強的化學致癌物之一，能導致食管癌、胃癌等消化道病變[4]。據世界衛生組織統計，全世界每年約500萬人被癌癥奪取生命[5]。現代藥理研究表明，許多天然果蔬中的活性成分如黃酮類[6]、酚類[7]等具有清除體內自由基和亞硝酸鹽成的作用，從天然果蔬中挖掘有效降低體內自由基水平以及抑制亞硝化反應活性的活性物質對保護機體健康具有重要意義。

金柑（Kumquat）為蕓香科（Rutaceae）金柑屬（Fortunella swingle）的一類水果，為柑橘屬的近緣屬[8]，又名金桔、金棗等，被稱為柑橘家族中的“小寶石”。金柑在中國的栽培歷史，最早可以追溯到三國時期的《臨海異物志》：“雞橘子大如指。味甘。永寧界中有之”，主要分布于我國廣東、廣西、江西和福建等地[9]。金柑富含金柑苷、維生素C（Vitamin C，VC）、黃酮、檸檬苦素等多種生物活性成分[10]，是一種營養價值高的水果。據《本草綱目》記載：金柑有“下氣、止渴、解腥、辟狐臭”之功效[11]。現代藥理研究顯示，金柑具有降血糖、降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒等作用[12-13]。我國是金柑的原產地，產量和栽培面積均居世界首位，資源豐富[14]，但存在基礎研究薄弱、精深加工滯后、產品單一等諸多問題[15]，且現有研究多集中于單一產地的品種，對不同產地金柑的總酚和總黃酮含量及其與抗氧化、抑制亞硝化活性的系統比較研究尚未見報道。為全面、系統地評價不同產地金柑的質量，試驗以廣東、廣西、江西、福建四個產地的金柑為研究對象，以總酚、總黃酮體外抗氧化活性、抑制亞硝化為指標，考察4個產地金柑的品質差異，并初步分析總酚、總黃酮含量與抗氧化、抑制亞硝化活性的相關性，為金柑資源進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金柑（Kumquat）分別采購于廣東蕉嶺、廣西融安、江西遂川、福建尤溪4個產地，經嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所張聲源副教授鑒定為蕓香科（Rutaceae）金柑屬（Fortunellaswingle）金柑（Kumquat）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2’-azinobis（3-ethylbenzothiaoline-6-sulphonic acid），ABTS]：美國Sigma公司；VC（西隴科學有限公司）；沒食子酸標準品、福林酚試劑（上海麥克林生化科技有限公司）；鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、無水三氯化鐵（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；試劑均為分析純。

FA2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；N-1100V型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；WJX-A1000型多功能高速粉碎機（上海緣沃工貿有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京市意成科技開發公司）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；GL-25M型離心機（上海趙迪生物科技有限公司）；PhSJ-3F型pH計（上海精科儀器有限公司）；JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

挑選大小均勻、果形正常、無病蟲害的成熟新鮮金柑果實（廣東蕉嶺金柑527.31 g、廣西融安金柑522.26 g、江西遂川金柑525.90 g、福建尤溪金柑526.20 g），切開，去籽，按料液比1∶3 g/mL加入95%乙醇回流提取3次，每次2 h，經8層紗布過濾，合并提取液，濃縮得到廣東蕉嶺金柑乙醇提取物61.00 g（提取率11.57%）、廣西融安金柑乙醇提取物63.30 g（提取率12%）、江西遂川金柑乙醇提取物59.90 g（提取率11.36%）、福建尤溪金柑乙醇提取物60.70 g（提取率11.53%），置于玻璃真空干燥器中保存備用。

1.2.2 總酚含量測定

采用Folin-Ciocaileu比色法[16-17]測總酚含量。取1.0 mL不同質量濃度的沒食子酸標準溶液到25 mL具塞比色管中，加入6.0 mL蒸餾水、0.5 mL福林試劑，充分搖勻（避光2 min），加2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，于40 ℃水浴10 min，然后于25 ℃水浴后暗置60 min，以空白試劑為參比，在760 nm波長處測定各吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y，繪制標準曲線。配制4個產地金柑樣品液，重復上述操作，平行測定3次。根據標準曲線回歸方程計算4個產地金柑的總酚含量。

1.2.3 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁法[18-19]測總黃酮含量。取1.0 mL不同質量濃度的蘆丁標準溶液置于25 mL具塞比色管中，加入6.0 mL蒸餾水，加1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置4 min，加1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置4 min，加10.0 mL 4%氫氧化鈉試液，加水至刻度，搖勻，放置10 min，以空白試劑為參比，在500 nm的波長處測定吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y，繪制標準曲線。配制4個產地金柑樣品液，重復上述操作，平行測定3次。根據標準曲線回歸方程計算4個產地金柑的總黃酮含量。

1.2.4 體外抗氧化活性評價

1.2.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[20-21]，并稍作改進。分別取2.0 mL不同質量濃度的樣品液或VC對照品標準溶液于6支試管中，分別加入2.0 mL DPPH自由基溶液，置于暗處，室溫反應20 min，以無水乙醇做空白對照，測定其在波長517 nm處的吸光度（Ai）。同法測定2.0 mL DPPH自由基溶液與2.0 mL無水乙醇混合后在波長517 nm處的吸光度（A0），測定2.0 mL無水乙醇溶液與2.0 mL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度（Aj），每個樣品平行測定3次，按式（1）計算金柑品和VC溶液對DPPH自由基的清除率。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力測定參考文獻[22-23]，并稍作改進。取100.0 μL樣品或VC溶液于試管中，加入3.9 mL ABTS工作液，振蕩，于暗處室溫反應10 min，測定其在波長734 nm處的吸光度（Ai）。同法測定3.9 mL ABTS工作液與100.0 μL無水乙醇混合后在波長734 nm處的吸光度（A0），3.9 mL磷酸緩沖溶液與100.0 μL樣品在波長734 nm處的吸光度（Aj）。每個樣品平行測定3次，按式（2）計算金柑和VC溶液對ABTS自由基的清除率。

1.2.4.3 普魯士藍法

鐵還原力的測定參考文獻[24]，并稍作改進。取2.5 mL樣品液或VC標準溶液、2.5 mL的磷酸緩沖液（PBS，pH 6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀溶液于10 mL試管中，搖勻，于50 ℃水浴反應20 min，急速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，取2.5 mL上述反應液于另一支試管中，加入2.0 mL蒸餾水與0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液混勻。以空白試劑作為對照，在波長700 nm處測得吸光度。試驗結果用VC當量表示，即每克樣品相當于多少μmoL的VC（μmoL VC/g）。

1.2.5 抑制亞硝化作用評價

1.2.5.1 亞硝酸鹽清除率的測定

亞硝酸鹽清除率的測定參照文獻[25]，并稍作改進。取1.0 mL樣品液或VC標準品溶液、2.0 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 3.0）、1.0 mL亞硝酸鈉溶液于25 mL棕色具塞比色管中，搖勻，于37 ℃水浴1 h，加入2.0 mL 0.4%對氨基苯磺酸，搖勻，靜置5 min，加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液混勻，用蒸餾水定容至刻度，靜置15 min后，以蒸餾水為參比，在波長538 nm下測定吸光度（Ai），同法測定空白對照組（A0）和樣品溶劑對照組（Aj），每個樣品平行測定3次，根據式（3）計算出樣品和VC溶液對亞硝酸鹽的清除率。

1.3 數據統計分析

試驗重復3次，采用Origin 2017和SPSS 25.0對數據進行處理分析，結果以“平均值±標準差”表示，并得到相應的半數清除濃度（IC50）。利用Pearson法進行總酚、總黃酮含量與抗氧化、抑制亞硝化活性的相關性分析，通過單因素分析及Duncan法檢驗多組數據間差異的顯著性。采用抗氧化活性綜合（antioxidant potency composite，APC）指數法按式（4）計算，對抗氧化活性進行系統的綜合評價。

2 結果與分析

2.1 4個產地金柑總酚、總黃酮含量分析

沒食子酸和蘆丁線性擬合方程和相關系數結果見表1。相關系數分別為0.997 3和0.998 2，線性關系良好。

表1 沒食子酸和蘆丁標準品的線性擬合回歸方程

4個產地金柑總酚、總黃酮含量分析見表2。4個產地總酚含量大小依次為廣西融安金柑＞江西遂川金柑＞福建尤溪金柑＞廣東蕉嶺金柑。總黃酮含量在含量大小依次為廣西融安金柑＞福建尤溪金柑＞江西遂川金柑＞廣東蕉嶺金柑。

表2 4個產地金柑常規營養成分中總酚與總黃酮含量（±s，n=3） 單位：mg/g

表2 4個產地金柑常規營養成分中總酚與總黃酮含量（±s，n=3） 單位：mg/g

指標 廣東蕉嶺 廣西融安 福建尤溪 江西遂川總酚 15．62±1．72a 26．84±4．59c 17．59±12．50a 20．61±4．14b總黃酮19．07±2．89a 24．07±2．46b 23．27±0．49b 22．95±1．90b注: 同行肩標相同英文字母表示差異性不顯著 (p＞0．05); 不同英文字母表示差異性顯著 (p＜0．05)。

2.2 體外抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

由圖1和表3可知，4個產地金柑清除DPPH自由基能力大小依次為廣西融安金柑＞江西遂川金柑＞福建尤溪金柑＞廣東蕉嶺金柑。江西遂川金柑與福建尤溪金柑對DPPH自由基的清除能力無顯著差異（p＞0.05）。其中，廣西融安金柑清除DPPH自由基能力最強，IC50=1.01±0.098 mg/mL。

表3 4個產地金柑對DPPH自由基清除率IC50（x±s，n=3） 單位：mg/mL

圖1 4個產地金柑清除DPPH自由基能力

2.2.2 ABTS自由基清除能力

由圖2和表4可知，4個產地金柑對ABTS自由基清除能力大小為福建尤溪金柑＞江西遂川金柑＞廣西融安金柑＞廣東蕉嶺金柑。其中，福建尤溪金柑與江西遂川金柑間無差異顯著（p＞0.05），該結果與DPPH自由基清除能力的結果一致。

表4 4個產地金柑對ABTS自由基清除率IC50（x±s，n=3） 單位：mg/mL

圖2 4個產地金柑清除ABTS自由基能力

2.2.3 鐵還原能力的測定

由圖3可知，不同產地金柑均具有一定Fe3+還原能力，還原能力大小依次為福建尤溪＞廣東蕉嶺＞廣西融安＞江西遂川。其中福建尤溪金柑VC當量為78.40±8.79 μmol VC/g。

圖3 4個產地金柑對鐵還原能力的影響

2.2.4 抗氧化活性的APC指數分析

4個產地金柑抗氧化活性的APC指數見表5。4個產地金柑的抗氧化活性APC指數在75.98%～93.16%之間，廣西融安金柑的綜合APC指數最高（93.16%），表明廣西融安金柑的綜合抗氧化能力最強。

表5 4個產地金柑抗氧化綜合評級

2.3 亞硝酸鹽清除能力

4 個產地金柑對亞硝酸鹽清除能力見圖4。4個產地金柑對亞硝酸鹽的清除能力大小為廣西融安金柑＞福建尤溪金柑＞江西遂川金柑＞廣東蕉嶺金柑。隨著質量濃度升高，其對亞硝酸鹽的清除率隨之增強，呈良好的劑量依賴效應。

圖4 4個產地金柑對亞硝酸鹽的清除能力

2.4 總酚和總黃酮含量與抗氧化和抑制亞硝化能力的相關性分析

4個產地金柑的總酚和總黃酮含量與抗氧化和抑制亞硝化能力的相關性見表6。4個產地金柑的總酚和總黃酮含量與抗氧化和抑制亞硝化能力均呈極顯著正相關（p＜0.01），說明金柑總酚和總黃酮越高，其抗氧化和抑制亞硝化能力越強。此外，金柑總酚含量對ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、鐵還原能力和清除亞硝酸鹽能力大于總黃酮含量。

表6 相關性分析結果

3 討論與結論

試驗通過測定4個產地金柑的總酚、總黃酮含量表明：總黃酮含量在19.07～24.07 mg/g之間，與鄭潔[15]研究15個品種金柑全果總黃酮含量范圍（13.27～23.76 mg/g）相一致；4個產地金柑總酚含量在15.62～26.84 mg/g之間，略高于楊聰穎等[26]測定金柑的總酚平均含量（11.03 mg/g），這可能與品種差異、產地、成熟度、采摘年份等有關[27]。

活性研究結果表明，在一定質量濃度范圍內4個產地金柑均有較強抗氧化和抑制亞硝化能力，在4個產地金柑體外抗氧化活性APC指數綜合評價中，廣西融安金柑的體外抗氧化活性綜合評價最高。由相關性分析結果可知，4個產地金柑酚類物質、黃酮類物質含量與抗氧化活性和抑制亞硝化呈顯著正相關（p＜ 0.01），提示酚類物質、黃酮類物質為金柑抗氧化能力和抑制亞硝化能力的主要物質，與唐巧玉等[28]和徐貴華等[29]研究發現金柑的酚類物質、黃酮類物質具有較強的抗氧化活性相一致。

通過對4個產地金柑總酚、總黃酮含量及抗氧化和抑制亞硝化活性的測定，結果發現廣西融安金柑總酚、黃酮的含量及抗氧化和抑制亞硝化活性最強，且成分含量與活性呈顯著正相關，為廣西融安金柑資源深入研究的合理開發利用提供試驗依據。