響應(yīng)面法優(yōu)化霍山石斛多糖超微低溫萃取工藝

王升貴，馬榮鋒

九仙尊霍山石斛股份有限公司（上海 201199）

霍山石斛屬蘭科石斛屬多年生草本植物，主要分布于安徽省霍山縣，屬于國家一級瀕危藥用植物。霍山石斛的食用歷史比較悠久，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味甘，平。主傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞、羸瘦，強陰。久服，厚腸胃、輕身、延年”。霍山石斛含多種活性物質(zhì)，其中霍山石斛多糖是其標志性成分，它具有增強免疫力[1]、抗氧化[2]、保護肝臟[3-4]、抗腫瘤[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗疲勞[8]、清咽[9]、抗炎[10-11]、增強腸道生理屏障和生化屏障等作用[12]。關(guān)于多糖提取工藝方面，有學者使用響應(yīng)面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖閃式提取工藝[13]、微波輔助法提取工藝[14]、復(fù)合酶法提取工藝[15]、水提法提取工藝[16-17]、超聲法提取工藝研究[18]等。另有研究報道響應(yīng)面法優(yōu)化回流水提法霍山石斛多糖[19-20]和超聲波提取工藝[21]。縱觀這些多糖提取工藝，主要是在傳統(tǒng)工藝上進行優(yōu)化。此次試驗采用創(chuàng)新的提取技術(shù)，利用響應(yīng)面法對霍山石斛多糖的超微低溫萃取法提取工藝進行研究與優(yōu)化，得到最佳工藝條件，以期為霍山石斛的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z. Tang & S.J. Cheng）鮮條，由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供。鑒定人為中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員。

葡聚糖標準品，Mr=50 000，中國藥品生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸、無水乙醇等均為分析純，市售；植物復(fù)合酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；蒸餾水，自制。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，金壇國勝試驗儀器廠；GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，上海標儀儀器有限公司；FA2204B分析天平，上海升隆電子科技有限公司；JS39D-250多功能食品加工機（攪拌機），蘇泊爾專賣店；紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超微低溫萃取工藝流程

霍山石斛鮮條→超微萃取→固液分離→低溫濃縮→低溫連續(xù)薄膜干燥→粉碎

1.2.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定樣品的多糖含量，多糖含量越高說明提取率越高。準確量取2 mL定容的多糖提取液，置15 mL離心管中，加入無水乙醇至一定體積分數(shù)，搖勻，于4 ℃冷藏一定時間，取出，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min）20 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻，搖勻。準確量取1.0 mL供試品溶液，置具塞試管中，按照標準曲線制作方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線數(shù)據(jù)和式（1）計算多糖提取率。

式中：X為樣品中粗多糖提取率（以無水葡萄糖計），mg/g；C為測試樣品的多糖質(zhì)量濃度，mg/L；M為樣品質(zhì)量，g；V1為樣品提取液定容總體積，mL；V2為沉淀粗多糖定容后體積，mL；V3為樣品測定液總體積，mL；V4為供沉淀多糖移取體積，mL；V5為樣品測定移取體積，mL。

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化霍山石斛提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取超微研磨細度（X1）、內(nèi)循環(huán)時間（X2）、料液比（X3）3個因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進行工藝優(yōu)化。通過Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到霍山石斛超微低溫萃取的最優(yōu)工藝參數(shù)。因素水平分析選取，見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗的因素及編碼值

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果

Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果，見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果

2.2 二次回歸模型的擬合及方差分析

對表2的結(jié)果進行響應(yīng)面二次回歸模型擬合，方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當置信度為95%時，內(nèi)循環(huán)時間和交互項X1X3、X2X3對Y影響不明顯。擬合的二次模型為：Y=59.62+1.69X1+0.46X2+1.10X3-1.48X1X2-0.25X1X3-0.50X2X3+0.15X12+2.50×10-3X22+ 0.28X32。方差結(jié)果顯示，該模型的一次項X1、X3的影響極顯著（p＜0.01），這表明超微研磨細度和料液比2個因素均與霍山石斛超微低溫萃取的多糖提取率高低有直接關(guān)系，是多糖超微低溫萃取的主要限制因子，其較小的變化可引起多糖提取率相當大的改變；超微研磨細度與內(nèi)循環(huán)時間的相互作用對霍山石斛多糖提取率的影響同樣達到極顯著水平（p＜0.01）。而X1X3、X2X3、X12、X22、X32的影響不明顯，說明超微研磨細度與料液比、內(nèi)循環(huán)時間與料液比的相互作用對霍山石斛多糖提取率的高低無顯著影響。而且，失擬項的p為0.134 0，沒有達到顯著水平，說明非試驗因素對試驗結(jié)果的影響不大。因此，所擬合的二次模型信任度高，能夠較好地解釋Y的數(shù)據(jù)群，該模型的決定系數(shù)R2=0.908，表明模型回歸擬合較好。多糖提取率的預(yù)測值和實際值之間有較好的擬合度，說明該模型較適合霍山石斛超微低溫萃取工藝優(yōu)化的篩選。

表3 回歸模型的方差分析

2.3 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對應(yīng)于試驗因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀地反映各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。將2個因素固定在零水平，利用Design Expert 8.0.6軟件可作出另外2種因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，結(jié)果見圖1～圖3。從各圖中的曲面變化形式的陡峭趨勢，可得出超微研磨細度與內(nèi)循環(huán)時間的相互作用對霍山石斛多糖提取率有較明顯的影響。根據(jù)響應(yīng)面試驗最優(yōu)值預(yù)測方法，預(yù)測出霍山石斛多糖超微低溫萃取的提取率的最大值64.102%，各單因素最優(yōu)值分別是超微研磨細度50.000 μm、內(nèi)循環(huán)時間5.000 s，料液比1∶30（g/mL）。

圖1 X1X2相互作用對霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X1=超微研磨細度，X2=內(nèi)循環(huán)時間）

圖3 X2X3相互作用對霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X2=內(nèi)循環(huán)時間，X3=料液比）

2.4 最佳提取工藝的驗證

根據(jù)響應(yīng)面試驗最優(yōu)值預(yù)測方法，預(yù)測出霍山石斛超聲波提取的最大提取率64.102%，為了進一步驗證該試驗結(jié)果的可性度，依據(jù)最佳條件進行試驗，為利于試驗操作，選取超微研磨細度50 μm、內(nèi)循環(huán)時間5 s、料液比1∶30（g/mL）進行3次平行驗證，霍山石斛多糖提取率平均值為64.04%，與優(yōu)化預(yù)測值非常接近，從而可以說明理論值與實測值之間具有良好的擬合性，表明了所建模型的有效性，說明回歸方程能較真實地反映各因素對霍山石斛超微低溫萃取的多糖提取率的影響。

圖2 X1X3相互作用對霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X1=超微研磨細度，X3=料液比）

3 結(jié)論與討論

利用超微低溫萃取技術(shù)進行霍山石斛提取物的制備，經(jīng)響應(yīng)面分析及優(yōu)化，得到霍山石斛超微低溫萃取的最佳工藝：超微研磨細度50 μm，內(nèi)循環(huán)時間5 s，料液比1∶30（g/mL）。此條件下的霍山石斛多糖提取率為64.04%。采用超微低溫萃取技術(shù)提取多糖，多糖提取率高于響應(yīng)面法優(yōu)化的超聲波多糖提取[21]和響應(yīng)面法優(yōu)化的回流水提多糖法[20]。研究表明溫度對石斛多糖的得率和抗氧化活性有影響，溫度越高多糖得率和抗氧化性降低[22]。同時，溫度對總多酚、總黃酮等活性物質(zhì)均有影響，比如吳振等[23]研究滅菌溫度越高，果汁中的多酚和黃酮損失越多。由此推斷超微低溫萃取技術(shù)對霍山石斛多糖的得率及其他易氧化的活性成分影響小。且霍山石斛藥用價值和保健價值已被廣泛證實，但其種植投入大且產(chǎn)量極低，5年只生長5 cm，以致其價格一直居高不下，充分提取其活性成分，可提升其綜合利用價值，并為產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。