紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料的工藝

尹蓉，張倩茹，茹建生，王賢萍，梁志宏*

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（太原 030031）

乳酸菌（Lactobacillus）是一種能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸的益生菌[1-2]。已知的乳酸菌至少可分為乳桿菌屬（Lactobacillus）、連球菌屬（Streptococeus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等18個(gè)屬，目前實(shí)際應(yīng)用的有德氏乳桿菌（L.delbrueckii）、保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophlus）、干酪乳桿菌（L.casei）、瑞士乳桿菌（L.helviticus）等[3-5]。乳酸菌發(fā)酵后的水果飲料中新產(chǎn)生的乳酸可增加柔和的口感，并具備益生活菌，其代謝產(chǎn)物具抗衰老、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、改善胃腸菌群等保健功效[5-6]。王玥等[7]利用柿子汁發(fā)酵乳酸菌飲料，通過穩(wěn)定性、口感和產(chǎn)品質(zhì)量的分析，篩選出的優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌種為植物乳桿菌，得到的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度33 ℃、菌種接種量4%、發(fā)酵時(shí)間14 h。高玉榮等[8]以嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵巨峰葡萄汁，通過單因素正交優(yōu)化試驗(yàn)，得出初始pH、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)嗜酸乳桿菌活菌數(shù)和感官品質(zhì)影響顯著，最佳工藝條件為初始pH 4.5、接種量2.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間26 h。此外，韋金娜等[9]對(duì)殺菌型百香果味乳酸菌飲料、劉秋豆等[10]對(duì)芒果汁乳酸菌發(fā)酵飲料、黃天等[11]對(duì)山藥益生菌飲料的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。

紅樹莓（Rubus idaeusL.）和山楂（Crataegus pinnatifidaL.）均含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和功能性成分，具有良好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[12-14]。將二者按一定比例混合制作成乳酸菌發(fā)酵飲品，將更好地提升功能性和商品性。對(duì)紅樹莓和山楂復(fù)合果汁的乳酸菌發(fā)酵工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，得出最佳工藝參數(shù)，豐富乳酸菌發(fā)酵工藝的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并為紅樹莓和山楂的利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮紅樹莓、山楂，產(chǎn)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所；葡萄糖、小蘇打粉、果葡糖漿，均為食品級(jí)。

ME204型電子分析天平[基睿電子科技（上海）有限公司]；JYZ-V18A渣汁分離榨汁機(jī)（九陽股份有限公司）；XZS-450過濾器（新鄉(xiāng)市先鋒振動(dòng)機(jī)械有限公司）；101-0A電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市通利信達(dá)儀器廠）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；Sartorius PB-10酸度計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 飲料制作步驟

1) 選取新鮮、無病蟲害的紅樹莓、山楂果清洗并晾干。

2) 將紅樹莓果直接用渣汁分離榨汁機(jī)打汁，進(jìn)行稀釋；山楂果加純凈水后打汁，分別留取汁液進(jìn)行過濾，備用。

3) 將制備好的紅樹莓、山楂汁稀釋汁以一定的比例混合，加入10%的葡萄糖。

4) 將上述混合果汁在80 ℃水浴鍋中滅菌20 min，取出后晾涼。

5) 加入直投式植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌干粉（質(zhì)量比為4∶3∶3），在37 ℃烘箱中恒溫發(fā)酵；

6) 加入10%果葡糖漿進(jìn)行調(diào)配。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

固定其他因素，以pH、活菌數(shù)、感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時(shí)間、果汁稀釋倍數(shù)、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比對(duì)乳酸菌發(fā)酵果汁品質(zhì)的影響。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、果汁稀釋倍數(shù)、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比進(jìn)行L9(43)正交試驗(yàn)，以活菌數(shù)和感官評(píng)分作為考核指標(biāo)，進(jìn)行極差分析和方差分析。

1.2.4 感官評(píng)價(jià)方法

參照GB/T 21732—2008《含乳飲料》[15]和T/LYFYA 004—2019《乳酸菌飲料》[16]，從色澤、口感、香氣、澄清度等方面制定紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[17-18]，請(qǐng)10位專業(yè)人員分別對(duì)飲料進(jìn)行感官評(píng)定，總分為100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

乳酸菌發(fā)酵需要一定的時(shí)間。時(shí)間過短，發(fā)酵不完全；時(shí)間過長(zhǎng)，又會(huì)形成過多的酸性物質(zhì)，影響果汁的風(fēng)味。因此，確定合適的發(fā)酵時(shí)間是制作乳酸菌果汁飲品的必需步驟。將制成的果汁按照1∶1的比例混合，稀釋3倍，添加1%的復(fù)合乳桿菌，在37 ℃下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，不同發(fā)酵時(shí)間下pH和活菌數(shù)如圖1所示。

由圖1可知：發(fā)酵果汁的pH隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定的趨勢(shì)，穩(wěn)定開始的時(shí)間點(diǎn)為發(fā)酵48 h，這是因?yàn)殡S著發(fā)酵中乳酸菌不斷地將果汁中的可酵糖轉(zhuǎn)化為乳酸，酸性物質(zhì)越來越多，直到可酵糖全部利用完，酸性物質(zhì)含量不再變化，使得果汁的pH變得穩(wěn)定。活菌數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先升高，到發(fā)酵48 h后不再有明顯變化，這說明發(fā)酵48 h后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料pH和活菌數(shù)的影響

2.1.2 果汁稀釋倍數(shù)的確定

紅樹莓和山楂酸度高，必須添加大量食用小蘇打才能有效降低樹莓汁和山楂汁酸度，但過多的小蘇打嚴(yán)重影響果汁色澤和風(fēng)味，因此需進(jìn)行稀釋后再發(fā)酵。將制成的果汁按照1∶1的比例混合，稀釋成不同的濃度，添加1%的復(fù)合乳桿菌，在37 ℃下進(jìn)行恒溫發(fā)酵48 h，pH和活菌數(shù)如圖1所示。

圖2顯示：在發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量固定的情況下，隨著紅樹莓山楂果汁稀釋倍數(shù)的增加，乳酸菌發(fā)酵果汁的pH呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢(shì)，活菌數(shù)隨著稀釋倍數(shù)的增加先升高后趨于平緩，因?yàn)檩^高濃度的果汁酸度高，影響乳酸菌的活性，稀釋倍數(shù)變大后，果汁酸度越來越適合乳酸菌增殖代謝，而稀釋倍數(shù)達(dá)到4后，pH變化不大，表明果汁酸度小，不會(huì)制約乳酸菌活性。考慮到果汁濃度越低，乳酸菌發(fā)酵果汁的風(fēng)味會(huì)越淡，因此稀釋4倍是果汁濃度的合適選擇。

圖2 果汁稀釋倍數(shù)對(duì)紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料pH和活菌數(shù)的影響

2.1.3 乳酸菌接種量的確定

過少的乳酸菌在酸性果汁中不足以啟動(dòng)發(fā)酵動(dòng)能，但過多乳酸菌因價(jià)格高，會(huì)增加發(fā)酵飲料的成本，因此需要確定乳酸菌的接種量。取4倍體積稀釋的1∶1混合果汁，添加不同量的混合乳酸菌發(fā)酵干粉，在37 ℃下進(jìn)行恒溫發(fā)酵48 h，pH和活菌數(shù)如圖3所示。

圖3 乳酸菌接種量對(duì)紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料PH和活菌數(shù)的影響

由圖3可知：在同樣的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間下，隨著乳酸菌接種量的增加，乳酸菌發(fā)酵果汁的pH呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢(shì)，活菌數(shù)隨著稀釋倍數(shù)的增加先升高后趨于平緩，二者均是在乳酸菌接種量為1%時(shí)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，說明此時(shí)乳酸菌的量與底物濃度比例最為合適，超過1%對(duì)乳酸菌的增殖無明顯影響。另外，發(fā)酵劑濃度過低，產(chǎn)酸速率慢，會(huì)拉長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，而發(fā)酵劑濃度過高，會(huì)極大提高產(chǎn)酸速率，研究表明產(chǎn)酸速率過快會(huì)使發(fā)酵液的風(fēng)味變差。因此，選擇乳酸菌接種量1%為最適宜濃度。

2.1.4 紅樹莓汁和山楂汁體積比的確定

紅樹莓汁和山楂汁體積比對(duì)最終風(fēng)味的形成有影響，在上述試驗(yàn)確定的發(fā)酵時(shí)間48 h、稀釋倍數(shù)4倍和乳酸菌接種濃度1%的條件下發(fā)酵，制作好的紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵果汁經(jīng)10位專業(yè)人士感官評(píng)價(jià)，依照表1打分，去掉最高分和最低分，結(jié)果見表2。

由表2可知，山楂汁比例大的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵果汁整體比紅樹莓汁比例大的感官評(píng)分高，在紅樹莓汁占比大的果汁中，紅樹莓汁比例越高評(píng)分越低。評(píng)分最高的為紅樹莓汁與山楂汁體積比1∶3的發(fā)酵果汁，其次為2∶3和1∶1的發(fā)酵果汁。

表2 不同紅樹莓汁和山楂汁體積比所得乳酸菌發(fā)酵果汁的感官評(píng)分

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

以發(fā)酵時(shí)間、稀釋倍數(shù)、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比為考察因子，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)（表3），研究其在紅樹莓山楂復(fù)合乳酸菌發(fā)酵果汁中的互作影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3和表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由表4可知：根據(jù)極差值R的大小，影響紅樹莓山楂復(fù)合乳酸發(fā)酵果汁活菌數(shù)的主次因素順序?yàn)槿樗峋臃N濃度＞果汁稀釋倍數(shù)＞發(fā)酵時(shí)間＞紅樹莓汁與山楂汁體積比，而影響感官評(píng)分的主次因素順序?yàn)榧t樹莓汁與山楂汁體積比＞乳酸菌接種濃度＞果汁稀釋倍數(shù)＞發(fā)酵時(shí)間，最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間60 h、果汁稀釋倍數(shù)3倍、乳酸菌接種濃度1%、紅樹莓汁與山楂汁體積比2∶3。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到活菌數(shù)的均值為7.56、感官評(píng)分均值為87.8的發(fā)酵果汁。

表4 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)方差分析結(jié)果（表5）：果汁稀釋倍數(shù)、乳酸菌接種濃度對(duì)紅樹莓山楂復(fù)合乳酸發(fā)酵果汁活菌數(shù)存在極顯著影響，而發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)存在顯著影響，其影響力大小順序?yàn)槿樗峋臃N濃度＞果汁稀釋倍數(shù)＞發(fā)酵時(shí)間＞紅樹莓汁與山楂汁體積比，與極差分析結(jié)果一致；紅樹莓汁與山楂汁體積比、乳酸菌接種濃度對(duì)發(fā)酵果汁感官評(píng)分分別存在極顯著和顯著影響，4個(gè)因素的影響力大小順序?yàn)榧t樹莓汁與山楂汁體積比＞乳酸菌接種濃度＞發(fā)酵時(shí)間＞果汁稀釋倍數(shù)，與極差分析結(jié)果略有不同，發(fā)酵時(shí)間、果汁稀釋倍數(shù)影響力在二者中正好相反。鑒于方差分析能夠準(zhǔn)確估算誤差，檢測(cè)精度更高，因此以方差分析結(jié)果為準(zhǔn)。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 討論與結(jié)論

紅樹莓、山楂復(fù)合果汁可以在稀釋且無需調(diào)pH的情況下，經(jīng)混合乳酸菌發(fā)酵，制作成風(fēng)味較佳的乳酸菌飲料。對(duì)比之前諸多的研究，因采用原汁發(fā)酵，都需添加碳酸鹽或鹽酸調(diào)節(jié)初始pH，大大降低了發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)。而此次研究雖將紅樹莓、山楂汁進(jìn)行了稀釋，但仍能較好地保持色澤和風(fēng)味，且與乳酸發(fā)酵物形成較好的契合，另外科學(xué)的配比也使最終的感官品質(zhì)提高，是值得提倡的乳酸發(fā)酵飲料。

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可知，果汁稀釋倍數(shù)、乳酸菌接種濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅樹莓山楂復(fù)合乳酸發(fā)酵果汁活菌數(shù)存在極顯著或顯著影響，紅樹莓汁與山楂汁體積比、乳酸菌接種濃度對(duì)發(fā)酵果汁感官評(píng)分分別存在極顯著和顯著影響，并得到最佳工藝參數(shù)：發(fā)酵時(shí)間60 h、果汁稀釋倍數(shù)3倍、乳酸菌接種濃度1%、紅樹莓汁與山楂汁體積比2∶3。在此工藝參數(shù)下，得到活菌數(shù)均值為7.56、感官評(píng)分均值為87.8的乳酸菌發(fā)酵果汁。