膠原-彈性蛋白多肽復合海綿的制備及表征

齊一瀟 ，羅思施*，雷靜，李奕恒，張俊杰段蕊*

1. 江蘇海洋大學食品科學與工程學院（連云港 222005）；2. 廣州創爾生物技術股份有限公司（廣州 510700）

膠原蛋白海綿是膠原基生物材料的一種重要產品形式。純膠原蛋白海綿力學性能較弱[1]，常通過復合殼聚糖[2-4]、聚乙醇酸（PGA）[5]等材料提高和改善其力學性能。產品各組分的特性會在復合材料中體現[6]，復配來自細胞外基質的天然成分有益于模仿天然細胞外基質的物理性能和生物學特性[7]。

彈性蛋白來自于細胞外基質，是一種高度不溶的蛋白質[8]，可賦予組織及器官彈性[9]，常通過脫細胞基質[10]、可溶性或不可溶性彈性蛋白[11]等形式用于皮膚修復、血管再生[12]等領域的研究。通過水解方式制成的彈性蛋白多肽，保留有彈性蛋白的特征結構域[13]；與膠原蛋白復配用于組織工程中，可提高膠原蛋白的力學性能[14]。彈性蛋白具有促進成纖維細胞和角質細胞增殖、誘導血管再生等生物學性能[15]，也可間接影響膠原蛋白對細胞的作用。因此，彈性蛋白多肽和膠原蛋白的復合，有望拓寬膠原蛋白海綿的應用范圍。

試驗將彈性蛋白多肽與膠原蛋白復配制備成復合海綿，從拉伸強度、彈性模量、吸水量、孔隙率以及微觀形貌等方面對膠原-彈性蛋白多肽復合海綿進行理化性能評價。通過細胞增殖試驗和細胞毒性試驗評價膠原-彈性蛋白多肽復合海綿對細胞活力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牛跟腱酸溶性膠原蛋白，廣州創爾生物技術股份有限公司；彈性蛋白多肽粉末，Elastinproducts公司；NIH-3T3細胞，中國科學院昆明野生動物細胞庫；L929細胞，中國科學院昆明野生動物細胞庫；無水乙醇，分析純，天津市大茂化學試劑廠；CCK-8試劑，碧云天公司；胎牛血清、DMEM培養基等試劑，GIBCO公司。

PT-1198小型亞拉力試驗機，寶大儀器；Q800動態熱機械分析儀，美國TA；ADP-B3XL-E0A-X凍干機，SP Scientific；MCO-18-AIC-PC細胞培養箱，ESCO；FM-500D倒置熒光顯微鏡，上海蒲丹光學儀器有限公司；SW-CJ-2FD生物安全柜，AIRTECH；BSA2245分析天平，Sartorius；SB-3200DTD超聲波清洗儀，Scientz；Merlin場發射掃描電鏡，德國Carl Zeiss AG。

1.2 試驗方法

1.2.1 海綿的制備

將膠原蛋白溶液用0.5 mol/L HAC稀釋，制成10 mg/mL的膠原蛋白溶液。將彈性蛋白多肽粉末完全溶解于pH 7.4的PBS溶液中，制成50 mg/mL的彈性蛋白多肽溶液。分別將膠原蛋白溶液和彈性蛋白多肽溶液按照表1的比例混合，在2～8 ℃環境下攪拌均勻，于37 ℃孵育5 h，冷凍干燥后保存在干燥器內備用。

表1 膠原-彈性蛋白多肽復合海綿材料組成 單位：g

1.2.2 海綿力學性能的檢測

用小型亞拉力試驗機檢測海綿的抗張強度，速率為10 mm/min。用動態熱機械分析儀測量海綿的彈性模量，速率為1 N/min。

1.2.3 海綿吸水量的檢測

將經過恒重的海綿稱重（M1）后，放入純化水中浸泡30 min，隨后稱量（M2）。吸水量按式（1）計算。

式中：W為吸水量，g；M1為干海綿質量，g；M2為浸水后海綿質量，g。

1.2.4 海綿孔隙率的檢測

在稱量瓶中盛滿無水乙醇后稱重（W1）。將經過恒重的海綿稱重（WS）后放入上述稱量瓶中，超聲后重新補足稱量瓶中的無水乙醇，再次稱重稱量瓶（W2）。取出稱量瓶內的海綿，稱量剩余的無水乙醇及稱量瓶的質量（W3）。孔隙率按式（2）計算。

式中：P為孔隙率，%；WS為干海綿質量，g；W1為盛滿無水乙醇的稱量瓶質量，g；W2為含有海綿、無水乙醇的稱量瓶質量，g；W3為含有剩余無水乙醇的稱量瓶質量。

1.2.5 掃描電鏡觀察

通過場發射掃描電鏡觀察海綿的表面和截面的微觀結構，并拍照分析。

1.2.6 成纖維細胞增殖試驗

將NIH-3T3細胞懸液接種在96孔板中，孵育24 h后加入復合海綿的浸提液，以加入等量細胞培養基作為空白對照組。將細胞培養24 h后用CCK-8試劑檢測細胞相對增殖率。相對增殖率按式（3）計算。

式中：RGR為相對增殖率，%；A為樣品組吸光度平均值；A0為空白對照組吸光度平均值。

1.2.7 海綿細胞毒性的檢測[16]

按照GB/T 16886.5—2017所述方法檢測。

1.2.8 統計學分析

運用SPSS 20.0統計學軟件對試驗結果進行方差分析及t檢驗，p＜0.05表示具有顯著性差異，p＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 海綿的力學性能分析

海綿較高的力學性能使其吸收液體后保持形態完整，拉伸延展后不易斷裂。此次研究測量海綿的抗張強度及彈性模量結果如圖1（A）和圖1（B）所示。C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的抗張強度分別為7.10±0.45，8.94±0.58和26.46±1.52 N。C8E0Y與C8E5Z相比具有顯著差異，C8E0Y與C8E10Z相比具有極顯著差異，C8E5Z與C8E10Z相比具有極顯著差異。表明在一定范圍內，彈性蛋白多肽的添加量與膠原蛋白復合海綿的抗張強度呈正相關。C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的彈性模量分別為241.45± 17.51，252.59±11.32和255.32±32.37 Pa，但三者之間無統計學差異，表明彈性蛋白多肽的添加對海綿彈性模量的影響甚微。

圖1 力學性能分析結果

2.2 海綿吸水量分析

C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的吸水量相對于海綿初始質量的倍數分別為28.35±4.78，12.39± 0.58和6.30±0.76（圖2），三者間均具有極顯著差異。在試驗過程中，與膠原蛋白海綿相比，膠原-彈性蛋白多肽復合海綿吸水后能維持完整形態。該結果表明，彈性蛋白多肽的添加對海綿的吸水性有較大影響，且該影響與添加量具有相關性。

圖2 海綿的吸水量

膠原蛋白海綿作為創面敷料使用時，能夠迅速吸收滲液，截留滲液中的細胞因子，有利于維持創面濕性環境，促進創面愈合[17]。但在研究中發現，膠原蛋白海綿吸水后表面迅速凝膠化，凝膠化后力學性能明顯降低，也易從創面滑脫。材料復配可能是改善海綿以上缺陷的一種方式。張立彥等[18]利用殼聚糖和膠原蛋白制備復合海綿，結果發現添加低相對分子質量的殼聚糖后復合海綿的吸水率下降，添加高相對分子質量的殼聚糖后其吸水率上升。該文章認為復合海綿吸水率下降意味著抗水性提高，海綿具有一定的抗水性，可以延緩其在創面上的溶化速度，降低形變程度，保持海綿的形態。在試驗中也發現，彈性蛋白多肽的添加雖然降低了海綿的吸水能力，但也降低了海綿遇水凝膠化的速度和程度。這種改變有利于復合海綿在吸收組織滲液后維持形態，粘附在傷口處，從而維持傷口濕性環境。

2.3 海綿孔隙率的分析

C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的孔隙率分別為95.44%±0.65%，102.58%±3.66%和55.47%± 5.88%（圖3）。C8E0Y與C8E5Z相比無顯著性差異，C8E0Y與C8E10Z相比具有極顯著差異，C8E5Z與C8E10Z相比具有極顯著差異。

圖3 海綿的孔隙率

海綿的孔隙率影響細胞行為，較高的孔隙率促進營養物質和氧氣的運輸，方便氣體交換，增加創面的氧含量，從而促進細胞增殖[19]。

另外，孔隙率不僅影響細胞行為，也對海綿的力學性能有影響，高孔隙率的海綿由于大量的空隙體積，會降低海綿的力學性能[20]。根據此次試驗對于膠原蛋白海綿（C8E0Y）和兩種膠原-彈性蛋白多肽復合海綿（C8E5Z、C8E10Z）的抗張強度檢測結果，C8E10Z海綿的抗張強度最高，與C8E0Y相比提高3.7倍，而C8E10Z的孔隙率則明顯低于C8E0Y，試驗表明海綿材料的抗張強度和孔隙率呈負相關，力學性能的提升會降低其孔隙率。該結果與Jones等[21]的研究結果一致。

2.4 海綿的微觀結構

如圖4所示：膠原蛋白海綿表面較為平整，有少量的褶皺和孔隙（圖4a）；截面呈網狀結構，連接松散，孔隙排列無規律（圖4b）；彈性蛋白多肽加入后，海綿表面呈現粗糙的形貌，形成明顯的孔隙（圖4c）和褶皺（圖4e）；截面呈開放的多孔結構，孔隙大小均一、排列有序，孔壁致密且無明顯的粉末聚集物（圖4 d、f）。因為彈性蛋白多肽相對分子質量較小（約6 000 Da），無法形成網絡結構，截面無明顯的粉末聚集物，說明彈性蛋白多肽均勻地與膠原蛋白結合，結合海綿的抗張強度測試結果，表明彈性蛋白多肽的添加使海綿的微觀形貌更均勻有序，從而提升海綿的抗張強度。Daniel等[7]發現在膠原蛋白溶液里加入可溶性的彈性蛋白，電鏡觀察膠原蛋白表面平滑無明顯凸起或雜質，同時可溶性彈性蛋白的添加增加了復合材料的剛度，這與研究檢測的結果相似。

圖4 海綿SEM圖像

根據此次試驗的檢測結果，膠原-彈性蛋白多肽復合海綿C8E5Z和C8E10Z相比于純膠原海綿C8E0Y的抗張強度均有顯著的提升。C8E5Z海綿具有比C8E10Z海綿更高的吸水量和孔隙率，既可以吸收創面滲出物，也可以延緩膠原凝膠化的進程，同時具有良好的孔隙率，為創面提供氧氣。綜合評定，選擇C8E5Z海綿繼續檢測其生物學性能。

2.5 成纖維細胞增殖情況及細胞毒性檢測結果

彈性蛋白多肽Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly的六肽重復氨基酸結構，與細胞上存在的彈性蛋白受體結合[22-23]，影響細胞信號傳遞和趨化，刺激成纖維細胞增殖和遷移[24]。含有彈性蛋白肽的生物材料可以對細胞產生生物效應，例如增加彈性蛋白的合成[25]，誘導成纖維細胞增殖[26]等，能夠促進傷口愈合。為了研究彈性蛋白多肽的添加對成纖維細胞增殖作用的影響，試驗使用C8E5Z的浸提液培養小鼠成纖維細胞（NIH-3T3）。細胞增殖檢測結果（圖5A）表明，C8E5Z海綿浸提液的細胞增殖率為109.83%，與添加細胞培養基的空白對照組相比有極顯著性差異，說明膠原-彈性蛋白多肽復合海綿C8E5Z具有促進成纖維細胞增殖的作用。

根據GB/T 16886.5，細胞存活率不小于70%，細胞毒性評級小于2級，認為材料不具有潛在細胞毒性。細胞毒性檢測結果（圖5B）表明，膠原-彈性蛋白多肽復合海綿的增殖率為102.49%，與添加細胞培養基的空白對照組相比有極顯著性差異，細胞毒性評級小于2級，無潛在細胞毒性。

圖5 試驗結果

3 結論

試驗利用彈性蛋白多肽與膠原蛋白復配制備復合海綿，并對其性能進行評價。研究表明，膠原-彈性蛋白多肽復合海綿具有較高的力學強度，吸水量及孔隙率低于膠原蛋白海綿，吸水后海綿凝膠化的速度延緩。細胞增殖試驗和細胞毒性試驗表明復合海綿具有良好的細胞相容性，可以促進成纖維細胞增殖，并且沒有潛在的細胞毒性。理想的創面敷料不僅需要足夠的力學性能保護創面，還需要具有良好的吸水量及孔隙率，有利于組織滲出液的快速吸收，同時為創面提供氧氣。此次試驗制備的復合海綿具有作為創面敷料的潛力。