超聲輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化

李惟棟，王永霞，孫敏，王娜，韓春超*

山東中醫(yī)藥大學藥學院（濟南 250355）

雞腿菇（Coprinus comatus）學名毛頭鬼傘，屬真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬。雞腿菇廣泛分布于世界各地，在我國主要產(chǎn)于北方各省[1]。現(xiàn)代研究表明雞腿菇具有抗氧化[2]、降血糖[3]、減輕肝損傷[4]、抗腫瘤[5]、提高免疫力[6]等功效，且雞腿菇栽培容易，適應性廣，因此針對雞腿菇的開發(fā)和應用前景廣闊[7]。

雞腿菇干品中蛋白質(zhì)含量占比11.8%～29.5%，其中氨基酸種類齊全，包含人體必需的8種氨基酸，值得強調(diào)的是，像雞腿菇這樣的蘑菇中的蛋白質(zhì)也很容易消化，通常消化率在71%～90%。2 g蘑菇蛋白質(zhì)等于1 g肉蛋白質(zhì)。因此，在東歐的蘑菇有時被稱為“森林肉”[8]。

針對雞腿菇蛋白質(zhì)提取的研究較少，試驗采用響應面優(yōu)化超聲波輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質(zhì)的工藝，并測定雞腿菇蛋白質(zhì)提取率和純度，為雞腿菇蛋白質(zhì)功能性研究及保健食品的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞腿菇子實體鮮品（徐州菇馨蘑菇農(nóng)場）；考馬斯G-250（天津市科密歐化學試劑有限公司）；牛血清標準蛋白（北京奧科斯科技有限公司）；氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCI）、磷酸（H3PO4）、95%乙醇、硫酸銅（CuSO2·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、對硝基苯酚（C6H5NO3）、乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）、無水乙酸鈉（CH3COONa）、乙酸（CH3COOH）、37%甲醛（HCHO）、乙酰丙酮（C5H8O2）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WD-9415F型超聲波清洗器（北京六一生物科技有限公司）；EU-2000A紫外可見分光光度計（上海昂科拉儀器有限公司）；PHS-3C PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；TDL-5-A旋轉(zhuǎn)離心機（上海安亭科學儀器廠）；FD-1A-50冷凍干燥機（杭州川一實驗儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

取新鮮雞腿菇置于40 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干，烘干后將雞腿菇置于超高速多功能粉碎機中粉碎并過0.180 mm（80目）孔徑篩，將雞腿菇粉末保存于真空干燥器中備用。

1.3.2 雞腿菇蛋白質(zhì)提取

取5 g雞腿菇粉末置于燒杯中，按照相應料液比（1∶10～1∶30 g/mL）加入蒸餾水溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)雞腿菇溶液pH 9～13，將燒杯置于超聲中，選擇相應的超聲頻率0～200 W，恒溫30～70 ℃振蕩一定時間（20～100 min）。常溫下冷卻后離心10 min（4 000 r/min），取上清液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至等電點，在4 ℃靜置沉淀12 h后，離心10 min（4 000 r/min），取沉淀用蒸餾水溶解后用0.1 mol/L NaOH調(diào)至中性，使用超濾除去鹽和小分子雜質(zhì)，最后用真空冷凍干燥機冷凍干燥得到雞腿菇蛋白質(zhì)粉末。

1.3.3 雞腿菇蛋白質(zhì)提取率測定

1.3.3.1 配制考馬斯亮藍溶液

取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加100 mL 85%磷酸，加水稀釋至1 L，棕色瓶保存。

1.3.3.2 牛血清蛋白標準曲線繪制

用 標準的結(jié)晶牛血清白蛋白（BSA）配制成20 mg/100 mL的標準蛋白溶液，取6支試管，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25 ℃）下放置15 min，在595 nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第1支試管作為空白對照液，以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.3 雞腿菇提取液蛋白含量測定

取2～3支試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.4 雞腿菇粉末蛋白質(zhì)含量測定

采用GB 5009.5—2016凱氏定氮法測定雞腿菇粉末蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.5 雞腿菇蛋白質(zhì)提取率計算

根據(jù)式（1）計算雞腿菇蛋白質(zhì)提取率。

1.3.4 單因素試驗

雞腿菇蛋白提取工藝中，固定提取工藝條件：pH 11、提取溫度40 ℃、提取時間40 min、料液比1∶20 g/mL、超聲頻率50 W，每次單因素試驗取5 g雞腿菇粉末，分別考察pH（9，10，11，12和13）、提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）、提取時間（20，40，60，80和100 min）、超聲頻率（0，50，100，150和200 W）這5個因素對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響，選擇pH、提取溫度、提取時間、料液比、超聲頻率5個因素中最優(yōu)的水平進行后續(xù)的響應面試驗。

1.3.5 響應面優(yōu)化

在1.3.4單因素試驗的基礎上，運用軟件設計專家（Design-Expert 12）中的響應面優(yōu)化設計，以A（pH）、B（提取時間）、C（超聲頻率）、D（提取溫度）這4個單因素為自變量，以雞腿菇蛋白質(zhì)提取率為響應值進行工藝條件優(yōu)化，相關試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面因素水平編碼

1.3.6 等電點測定

用移液槍吸取5組雞腿菇提取液（pH 11），每組10 mL。分別用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)各組提取液pH至2.5，3.0，3.5，4.0和4.5，在4 ℃靜置2 h后，離心（4 000 r/min，10 min），取上清液。用移液槍吸取1 mL上清液，加入4 mL考馬斯亮藍溶液，振蕩混勻5 min后，在595 nm處測定吸光度，吸光度的最小值為雞腿菇蛋白質(zhì)等電點。

1.3.7 雞腿菇蛋白質(zhì)純度測定

將最優(yōu)條件下的雞腿菇提取液調(diào)節(jié)至雞腿菇蛋白質(zhì)等電點，靜置1 h后離心取沉淀，將沉淀進行超濾后，冷凍干燥后得到雞腿菇蛋白質(zhì)粉末。采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定雞腿菇蛋白質(zhì)粉末的蛋白質(zhì)含量。雞腿菇蛋白質(zhì)純度根據(jù)式（2）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

固定提取時間40 min、超聲頻率50 W、提取溫度40 ℃、料液比1∶20 g/mL，不同pH對蛋白質(zhì)提取率影響如圖1所示。隨著提取液pH不斷升高，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，其中在pH 9～12的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率增幅明顯，pH 12時提取率達到最大的30.3%，這可能是因為在堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，同時蛋白質(zhì)分子的次級鍵被破壞，從而促進蛋白質(zhì)溶解度增加[9-10]。pH繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)提取率反而下降，這可能是由于過高的pH導致蛋白質(zhì)過度水解和變性，從而降低了蛋白質(zhì)溶解度[11]。因此，選擇pH 11，12和13進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

圖1 pH對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.2 提取時間對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

固定提取pH 11、超聲頻率50 W、提取溫度40 ℃、料液比1∶20 g/mL，不同提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響如圖2所示。在一定范圍內(nèi)，雞腿菇蛋白質(zhì)提取率隨提取時間的延長，提取率呈上升趨勢，在60 min時提取率達到最大值27.31%，但是超過60 min后蛋白質(zhì)提取率逐步下降，這可能是由于提取時間短，蛋白質(zhì)溶出不充分，而時間過長導致蛋白質(zhì)在堿溶液中過度水解和變性，從而使提取率降低，同時增加多余雜質(zhì)溶出[12]。因此選擇提取時間40，60和80 min進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

圖2 提取時間對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.3 超聲頻率對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖3所示，隨著超聲頻率增加，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，超聲頻率100 W時，蛋白質(zhì)提取率達到最大值27.56%，這可能是因為隨著超聲頻率增大，空化作用和機械作用愈加強烈，分子擴散速度加快，促進蛋白質(zhì)溶出[13]，同時超聲頻率過大，可能促進某些蛋白酶溶出或蛋白質(zhì)變性，導致蛋白質(zhì)提取率下降[14]。因此選擇超聲頻率50，100和150 W進行響應面優(yōu)化試驗。

圖3 超聲頻率對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.4 溫度對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖4所示，隨著溫度升高，蛋白提取率也隨之增大，溫度超過40 ℃時，呈現(xiàn)明顯下降趨勢。溫度低于40 ℃時，溫度較低，反應速度較慢，隨著溫度的上升，分子間運動加劇，有效碰撞次數(shù)增多，反應速率的提升導致提取率的上升。40 ℃時蛋白提取率達到最高值，為24.76%，溫度超過40 ℃時，高溫會破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，蛋白質(zhì)疏水基團展開暴露，蛋白質(zhì)變性使提取率下降[15-16]。因此選取30，40和50 ℃進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

圖4 提取溫度對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.5 料液比對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

如圖5所示，隨著提取料液比中液體比例增加，蛋白質(zhì)提取率不斷增大，在1∶25 g/mL后蛋白質(zhì)提取率趨于平穩(wěn)。

圖5 料液比對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以影響雞腿菇蛋白提取率的提取液pH、提取時間、超聲頻率、提取溫度為自變量，以蛋白提取率為響應面的響應值，利用Box- Behnken共設計29組試驗，因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結(jié)果

2.2.2 響應面模型的建立及分析

Box-Behnken試驗設計及結(jié)果如圖1所示，利用Design-Expert 12.0進行二次多元回歸擬合，得到pH（A）、時間（B）、超聲頻率（C）和提取溫度（D）與響應值提取率（Y）的關系。多元二次回歸方程為：Y=29.68+3.43A-0.752 6B+3.03C+1.08D+2.52AB+ 0.540 4AC+1.5AD+1.3BC-1.03BD+1.19CD-3.85A2-1.95B2-4.18C2-4.94D2。

根據(jù)表3的方差分析結(jié)果可知，該響應面模型差異極顯著（p＜0.000 1），模型失擬項不顯著（p= 0.331 7＞0.05），說明試驗方法與設計可靠、合理，且其他未知因素對該試驗結(jié)果影響較小。方程模型的確定系數(shù)R2=0.941 5，模型擬合良好，模型成立。由p值可知：一次項A、C，二次項A2、B2、C2和D2和交互項AB對蛋白得率影響極顯著（p＜0.01）；一次項D的p值小于0.05，作用顯著；一次項B，交互項AC、AD、BC、BD、CD的p值大于0.05，交互作用不顯著。由F值可知各因素對蛋白提取率影響的大小為A＞C＞D＞B，即pH＞超聲頻率＞提取溫度＞提取時間。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.3 交互作用對蛋白提取率影響的響應面分析

響應面曲面和等高線共同反映各因素對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率的影響大小[17]。如圖6所示，pH與提取時間的交互作用顯著，其中pH的變化對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率影響最大。結(jié)合圖6可知，提取溫度、提取時間、超聲頻率兩兩之間的交互作用相對較小，提取率對超聲頻率改變的敏感程度大于提取溫度，提取率對提取時間改變的敏感程度最低。因此4個因素對雞腿菇蛋白質(zhì)提取率影響次序為pH＞超聲頻率＞提取溫度＞提取時間。與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互對雞腿菇蛋白提取率影響的響應面圖

2.2.4 最佳工藝驗證試驗

利用Desig-Expert 12.0軟件優(yōu)化回歸模型進行的工藝參數(shù)，確定提取雞腿菇蛋白質(zhì)的最適工藝條件：pH 12.62、提取時間66.27 min、超聲頻率124.23 W、提取溫度42.31 ℃，預測蛋白質(zhì)提取率為31.49%。為證明響應面優(yōu)化設計的合理性與可靠性，進行試驗驗證。考慮到實際操作的可行性，將工藝條件修改為pH 12.6、提取時間66 min、超聲頻率125 W、提取溫度42 ℃。進行3次驗證試驗，得到的蛋白提取率為32.02%±0.35%。這與模型預測值的相對偏差為1.6%，說明該提取條件參數(shù)可靠，具有較好的可行性。

2.3 雞腿菇蛋白質(zhì)等電點

如圖7所示，pH 3時，上清液的吸光度最低，為曲線的最低點，說明此時上清液中蛋白質(zhì)含量最低。蛋白質(zhì)處于等電點時，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷與負電荷恰好相等，相同電荷間作用力抵消，因此極易發(fā)生碰撞而產(chǎn)生沉淀，導致蛋白質(zhì)容易析出。所以pH 3為雞腿菇蛋白質(zhì)等電點。

圖7 雞腿菇蛋白質(zhì)等電點

2.4 雞腿菇蛋白質(zhì)凍干粉含量測定

按照1.3.7的方法測定雞腿菇凍干粉中蛋白質(zhì)含量，經(jīng)過測定，蛋白質(zhì)雞腿菇凍干粉末中蛋白質(zhì)含量為84.51%。

3 結(jié)論

采用超聲輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質(zhì)，并結(jié)合響應面優(yōu)化設計得到雞腿菇蛋白提取的最佳工藝，確定最佳提取工藝：pH 12.6、提取溫度42 ℃、提取時間66 min、超聲頻率125 W。在此條件下進行3次核對檢驗試驗，雞腿菇蛋白質(zhì)提取率為32.02%± 0.35%，這與模型預測值的相對偏差為1.6%，說明該模型對試驗擬合程度較高，工藝合理可靠。同時經(jīng)過試驗檢測雞腿菇蛋白質(zhì)凍干粉含量為84.5%，說明經(jīng)過該法提取的雞腿菇蛋白質(zhì)含量占比較高，進一步純化成本低。該試驗結(jié)果可為雞腿菇提供利用途徑。