不同前處理方法對(duì)糧油中黃曲霉毒素B1檢測效果對(duì)比

黃 力, 楊 靜, 李滑滑, 洪 玲, 沈 娜, 曾奎杰

(湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心；稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，長沙 410201)

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物， 其中AFB1毒性和危害最大，且熱穩(wěn)定好，268 ℃以上的高溫下才裂解。世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素確定為1A類致癌物，具有致癌、致畸和引起肝臟損傷的作用[1，2]。糧食和油料作物中黃曲霉毒素的污染問題受到了廣泛關(guān)注，世界各個(gè)國家和地區(qū)均對(duì)其制定了限量標(biāo)準(zhǔn)[3，4]。因此，對(duì)糧食和油料作物中黃曲霉毒素進(jìn)行準(zhǔn)確檢測就顯得十分關(guān)鍵。

高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精確定量，但基于黃曲霉毒素樣品基質(zhì)復(fù)雜、含量低等問題，常需要進(jìn)行樣品前處理使其富集純化。目前，免疫親和柱凈化處理其具有基質(zhì)干擾少、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛的應(yīng)用[5-8]，并且大部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品中黃曲霉毒素檢測前處理時(shí)常采用手動(dòng)凈化處理。隨著科技的進(jìn)步，為了簡化前處理過程，提高檢測的自動(dòng)化水平和檢測效率，一些學(xué)者已研制全自動(dòng)親和純化儀、免疫磁珠-全自動(dòng)凈化儀等前處理儀器應(yīng)用于食品中真菌毒素的檢測[9-11]。針對(duì)國內(nèi)外文獻(xiàn)還沒有系統(tǒng)地對(duì)比研究這3種前處理方法測定糧油中黃曲霉毒素的凈化效果，本研究通過優(yōu)化色譜條件后，建立柱后光化學(xué)衍生-高效液相色譜法，從加標(biāo)回收率、實(shí)樣檢測、檢測時(shí)長、操作步驟及凈化效果等多個(gè)角度考察了常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化、全自動(dòng)親和柱凈化及免疫磁珠-全自動(dòng)凈化3種前處理方法對(duì)糧油中黃曲霉毒素B1的殘留凈化效果的影響，以探討這3種前處理方法對(duì)糧油中黃曲霉毒素B1檢測的適用性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，230 Volt, 50 Hz,8 Watt光衍生器，JJHZ-10免疫磁珠-全自動(dòng)凈化儀，KY-APS-Ⅱ全自動(dòng)親和純化儀。

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AFB1含量為1.083 μg/mL)、黃曲霉毒素B1免疫親和柱、黃曲霉毒素B1免疫磁珠試劑盒、乙腈、甲醇為色譜純、超純水由明澈-D24uv超純水機(jī)制備、稻谷、玉米、花生油質(zhì)控樣品(MRM0011)、氯化鈉為分析純、微纖維濾紙。

1.2 試樣制備及提取

采樣量需大于1 kg，稻谷去除雜質(zhì)，經(jīng)礱谷機(jī)去殼制得糙米，粉碎，過篩，使其粒徑小于2 mm孔徑實(shí)驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100 g，儲(chǔ)于樣品瓶中備用。

稱取5 g試樣(精確到0.01 g)，加入1.0 g氯化鈉，于50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇水溶液提取液，渦旋混勻，置搖床(200～300 r/min)劇烈振蕩20 min，在4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3 常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液，作為上樣液。

凈化過程：免疫親和柱平衡后，柱上面連接25 mL一次性注射器，準(zhǔn)確移取15 mL上樣液，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2 d/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 mL ；待液體排干后，上樣1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脫液，用水稀釋定量至2 mL，最后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

1.4 全自動(dòng)親和柱凈化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液。

將親和柱與上樣管按照要求組合后，準(zhǔn)確移入上樣液15 mL，啟動(dòng)全自動(dòng)親和凈化儀，等程序結(jié)束后，向收集管中加入1.0 mL純水，混合后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于液相分析。

1.5 免疫磁珠-全自動(dòng)凈化

取1.2上清液1.0 mL，加入試劑盒的樣品孔(1孔位)中，將試劑盒放入免疫磁珠-自動(dòng)凈化儀，啟動(dòng)儀器，待自檢完成后，通過二維碼掃入凈化程序，運(yùn)行程序。

程序結(jié)束后，向樣品孔(5孔位)加入0.5 mL純水，混合后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

免疫磁珠試劑盒重復(fù)處理方法：將首次使用過的免疫磁珠試劑盒樣品孔(5孔位)吹干，準(zhǔn)確移取0.5 mL甲醇，重新置于免疫磁珠-自動(dòng)凈化儀進(jìn)行使用。

1.6 優(yōu)化后液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：64%水+18%甲醇+18%乙腈；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：100 μL；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取質(zhì)量濃度為1.083 μg/mL 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入50%甲醇溶液，將其依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.677、1.354、2.708、5.415、10.830、21.660ng/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化色譜條件

由于黃曲霉毒素在糧油中主要是以AFB1、AFB2、AFG1及AFG24種形式存在，并且黃曲霉毒素AFB1、AFG1在水溶液中易發(fā)生熒光淬滅，在進(jìn)行高效液相色譜法測定前要衍生化處理。所以本研究采用柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜法，可使AFB1、AFG1熒光強(qiáng)度大大提高，其方法還具有不需要特殊的化學(xué)試劑、衍生過程簡單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。

糧油提取物中化學(xué)成分復(fù)雜，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相配比進(jìn)行了詳細(xì)的考察。本實(shí)驗(yàn)考察了ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)和ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)對(duì)目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，采用ZORBAX Eclipse plus C18和ZORBAX SB-C18[8]均能較好地分離糧油中AFB1、AFB2、AFG1及AFG24種形式的黃曲霉毒素，尤其是ZORBAX Eclipse plus C18能使AFB1目標(biāo)化合物峰形更加的對(duì)稱，且能保證在流動(dòng)相配比不同情況下，AFB1峰面積都能基本一致(見圖1)。因此本研究選擇ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)分離AFB1。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相配比(60%水+20%甲醇+20%乙腈、64%水+18%甲醇+18%乙腈、68%水+16%甲醇+16%乙腈)對(duì)目標(biāo)化合物分離效果的影響(見圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加水相配比，可使4種形式的黃曲霉毒素分離的更開，但耗時(shí)更長。因此，結(jié)合目標(biāo)化合物的分離度和保留時(shí)間，最終選擇流動(dòng)相配比64%水+18%甲醇+18%乙腈。

注：a為60%水+20%甲醇+20%乙腈；b為64%水+18%甲醇+18%乙腈；c為68%水+16%甲醇+16%乙腈。圖1 采用不同流動(dòng)相配比時(shí)黃曲霉毒素的色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以1.083 μg/mL 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋所得的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液( 0.677～21.660 ng/mL)，在確定的色譜條件下進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1含量在0.677～21.660 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：If=1.757c+0.037，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 97。在空白稻谷樣品中添加目標(biāo)化合物，以3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)為0.029 μg/kg；以10倍的倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)為0.097 μg/kg，完全能滿足糧食中黃曲霉毒素B1的測定需求。

2.3 準(zhǔn)確性和重復(fù)性

選取不含黃曲霉毒素B1的稻谷樣品進(jìn)行加標(biāo)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，樣品中添加了不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加量相當(dāng)于黃曲霉毒素B1含量5.0、10.0、20.0 μg/kg)后，放置60 min，使待測成分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡，再應(yīng)用3種前處理方法進(jìn)行操作，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表1。3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率為82.1%～99.2%，3次重復(fù)測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～8.8%，符合一般痕量分析要求。與其他2種前處理測定結(jié)果相比較，全自動(dòng)親和柱凈化的回收率偏低，3次重復(fù)測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大。

表1 稻谷中黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.4 實(shí)際樣品分析

選取1份花生油質(zhì)控樣品(MRM0011)、1份陽性稻谷樣品和1份陽性玉米樣品分別利用已建立光化學(xué)衍生-高效液相色譜分析方法對(duì)其所含黃曲霉毒素B1進(jìn)行測定(見表2)。其中陽性稻谷樣品中黃曲霉毒素B1的色譜圖見圖2(常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化和全自動(dòng)親和柱凈化最終稀釋倍數(shù)為2；免疫磁珠-全自動(dòng)凈化最終稀釋倍數(shù)為5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種前處理方法對(duì)糧油中黃曲霉毒素B1的測定均能達(dá)到較好的效果，常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化和免疫磁珠-全自動(dòng)凈化的效果更加的明顯，其中免疫磁珠-全自動(dòng)凈化可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，且結(jié)果影響較小。

表2 3種前處理方法測得實(shí)際樣品中黃曲霉毒素B1的含量(n=3)

圖2 3種前處理方法對(duì)陽性稻谷樣品中黃曲霉毒素B1的色譜圖

2.5 3種前處理操作過程比較

本實(shí)驗(yàn)從檢測時(shí)長、操作步驟及凈化效果考察了常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化、全自動(dòng)親和柱凈化及免疫磁珠-全自動(dòng)凈化3種前處理凈化方法。從檢測時(shí)長來看，因常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化需要單個(gè)手動(dòng)操作，每一個(gè)樣品凈化時(shí)長約30 min；全自動(dòng)親和柱凈化采用全自動(dòng)親和純化儀，引入自動(dòng)進(jìn)樣器，可實(shí)現(xiàn)30 min內(nèi)凈化約15個(gè)樣品；免疫磁珠-全自動(dòng)凈化采用免疫磁珠試劑盒，同時(shí)處理10個(gè)樣品能在30 min內(nèi)凈化完成。從操作步驟來看，常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化和全自動(dòng)親和柱凈化兩者的操作步驟依次都是經(jīng)過樣品提取、稀釋、上樣、洗滌和洗脫，免疫磁珠-全自動(dòng)凈化是將樣品中真菌毒素提取后，直接準(zhǔn)確加入提取的上清液，二維碼掃描導(dǎo)入或調(diào)用程序，一鍵式操作。常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化和全自動(dòng)親和柱凈化兩種前處理方法為了防止堵塞親和柱，都需對(duì)提取的樣液進(jìn)行稀釋、微纖維濾紙預(yù)過濾處理，從而使其操作步驟繁瑣。從凈化效果來看，常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化在空白稻谷基質(zhì)條件下加標(biāo)3梯度回收率范圍在95.4%～99.2%，全自動(dòng)親和柱凈化為82.1%～89.9%，免疫磁珠-全自動(dòng)凈化首次使用為92.6%～96.5%，免疫磁珠-全自動(dòng)凈化重復(fù)使用為90.8%～93.3%，這與實(shí)際樣品分析結(jié)果一致。可見，全自動(dòng)親和柱凈化效果低于另外2種前處理方法，其原因可能是與全自動(dòng)親和純化儀在上樣流速、氣推次數(shù)等因素設(shè)定不當(dāng)影響到凈化效果[9]。但總的來說，3種前處理方法對(duì)糧油中黃曲霉毒素B1的測定均能達(dá)到較好的效果，常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化和免疫磁珠-全自動(dòng)凈化的效果更加的明顯，其中免疫磁珠-全自動(dòng)凈化還實(shí)現(xiàn)了重復(fù)利用，且耗時(shí)最短。

3 結(jié)論

本研究建立了以甲醇+水(70∶30)為提取液，以常規(guī)手動(dòng)親和柱凈化、全自動(dòng)親和柱凈化及免疫磁珠-全自動(dòng)凈化3種前處理凈化手段，光化學(xué)衍生-高效液相色譜為檢測儀器的黃曲霉毒素B1的檢測方法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，3種前處理凈化手段均適合糧油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理，但免疫磁珠-全自動(dòng)凈化更能突顯其優(yōu)勢(shì)，該方法快速簡便、定量準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，可以廣泛用于糧油中黃曲霉毒素B1的檢測。