液液萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素

王朝霞, 尹芳平, 汪 輝, 周 鵬, 鄧 楠, 曾 輝, 胡宇格

(食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1， 長(zhǎng)沙 410111) (長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所；國(guó)家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心2，長(zhǎng)沙 410000)

細(xì)菌毒素是由細(xì)菌合成產(chǎn)生的，按其毒素的分子性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征可分為內(nèi)毒素和外毒素。研究表明內(nèi)毒素是在革蘭氏陰性菌死亡之后才會(huì)產(chǎn)生，且能夠在植物中產(chǎn)生具有毒害性的代謝產(chǎn)物，影響植物的正常生長(zhǎng)從而降低植物如水稻這一類農(nóng)作物的產(chǎn)量[1-3]。由于革蘭氏陰性菌死亡之后產(chǎn)生的具有毒害性的代謝產(chǎn)物極易被人體吸收和利用，若人們攝取吸收富集這類物質(zhì)達(dá)到一定程度就會(huì)有不同程度的中毒跡象，輕者會(huì)出現(xiàn)嘔吐、全身無(wú)力、頭暈等現(xiàn)象；重者會(huì)出現(xiàn)內(nèi)臟腫大、休克等多種嚴(yán)重疾病[4-6]。吳小林等[7]研究了細(xì)菌毒素對(duì)癌癥的潛在作用，明確指出革蘭氏陰性菌具有致癌性。趙乃欣等[4]研究也表明，近年來(lái)中國(guó)不少地區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)由玉米粉、米粉等變質(zhì)產(chǎn)生革蘭氏陰性菌死亡后產(chǎn)生內(nèi)毒素進(jìn)而引起的食物中毒事件，其中報(bào)道較多的是由革蘭氏陰性菌死亡產(chǎn)生的毒黃素。毒黃素溶于水，同時(shí)也溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，靜脈注射毒黃素的LD50為1.7 mg/kg，口服的為8.39 mg/kg[8]。龍海等[9]研究發(fā)現(xiàn)水稻細(xì)菌性谷枯病病菌會(huì)產(chǎn)生3種毒素：毒黃素、熱誠(chéng)菌素和路霉素，其中毒黃素對(duì)水稻有極大的毒害作用。熱誠(chéng)菌素、路霉素與毒黃素分子結(jié)構(gòu)相似，可能存在與之相當(dāng)?shù)纳锘钚院投拘?。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的某些細(xì)菌物質(zhì)不僅會(huì)影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，還對(duì)人類身體健康產(chǎn)生不同程度的危害。Zhu 等[10]報(bào)道在釀酒大曲中檢出的毒黃素含量高達(dá)8.33 mg/kg。因此，植物油相關(guān)的原材料如果受到細(xì)菌污染，可能會(huì)產(chǎn)生毒素，影響植物油的安全。目前，國(guó)內(nèi)外主要以植物油[11]為食用油，關(guān)于植物油中真菌毒素的測(cè)定報(bào)道較多[12，13]，而食用植物油中細(xì)菌毒素的檢測(cè)方法研究卻是處于空白階段，消費(fèi)者在食用植物油環(huán)節(jié)存在一定的安全隱患，因此該項(xiàng)研究十分必要。我國(guó)食用植物油種類豐富、工藝復(fù)雜。常見(jiàn)的食用植物油[14]有菜籽油、玉米油、稻米油、花生油以及大豆油等。根據(jù)我國(guó)目前因細(xì)菌毒素中毒案例[5,6]來(lái)分析，本研究選擇了市面上主要流通的幾類食用植物油進(jìn)行分析檢測(cè)，因水稻中產(chǎn)生的細(xì)菌毒素誘發(fā)的疾病數(shù)量最多[15，16]，著重以稻米油為研究對(duì)象進(jìn)行展開(kāi)。

有關(guān)毒黃素的分析方法有薄層色譜法[17-19]、高效液相色譜法[8, 10, 20]、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[21，22]、分光光度法[23，24]、生物傳感法[25]，而對(duì)路霉素和熱誠(chéng)菌素的分析方法報(bào)道較少，且鮮有關(guān)于植物油中毒黃素、熱誠(chéng)菌素和路霉素的報(bào)道。本研究考察了5種不同前處理?xiàng)l件來(lái)提取凈化目標(biāo)物，采用甲醇液液萃取，高效液相色譜分析檢測(cè)，建立了一種快速測(cè)定食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的分析方法。以期填補(bǔ)食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素檢測(cè)方法研究的空缺，為今后對(duì)細(xì)菌毒素的研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毒黃素(Toxoflavin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)：CAS號(hào)：84-82-2；熱誠(chéng)菌素(Fervenulin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.2%)：CAS號(hào)：483-57-8；路霉素(reumycin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%)，CAS號(hào)：5016-18-2；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷和甲酸均為色譜純；正己烷、三氧化二鋁和無(wú)水硫酸鈉為分析純；Al2O3固相萃取柱(22 g/60 mL)；植物油均為市售樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀，SK-I振蕩器；CT14D-高速離心機(jī)，Visiprep-DL24固相萃取真空裝置，AS3120超聲波清洗器，超純水儀，N-EVAP116型氮吹儀-34位。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18色譜柱(4.6 mm×25 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸-甲醇(90∶10)，等度洗脫；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，再用甲醇定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，配制成0、4、8、10、20、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，供高效液相色譜儀分析測(cè)定。

1.3.3 樣品處理1.3.3.1 液液萃取法1.3.3.1.1 液液萃取-乙腈飽和正己烷[26]

稱取混勻的稻米油樣品0.8 g置于50 mL聚丙烯離心管中，加入0.2 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，加入10 mL乙腈的飽和正己烷，混勻超聲15 min，取出下層溶液，加入5 mL乙腈飽和正己烷復(fù)提，合并提取液，混勻于45 ℃氮吹濃縮至近干，用流動(dòng)相定容至2.0 mL，渦旋混勻，溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，并做空白實(shí)驗(yàn)，供液相色譜測(cè)定。

1.3.3.1.2 液液萃取-甲醇[27]

稱取混勻后的稻米油樣品4.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，樣品加入0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)母液，加入10 mL甲醇，室溫振蕩提取15 min，于10 000r/min離心5 min，取出溶劑，再加入6 mL甲醇重復(fù)提取，合并提取液并定容至20 mL。準(zhǔn)確移取5.0 mL樣液于45 ℃氮吹濃縮至近干，流動(dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻，溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，并做空白實(shí)驗(yàn)，供液相色譜測(cè)定。

1.3.3.2 固相萃取法

1.3.3.2.1 Al2O3固相萃取柱(30 mL正己烷活化)[28]

稱取混勻的稻米油樣品0.4 g置于50 mL聚丙烯離心管，加入0.1 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，加入5 mL正己烷，渦旋混勻，待凈化。采用中性氧化鋁固相萃取柱，用30 mL正己烷活化柱子，將待凈化樣液全部加入固相柱，再加入50 mL正己烷進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于45 ℃氮吹濃縮至近干，用流動(dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻，溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，并做空白實(shí)驗(yàn)，供液相色譜測(cè)定。

1.3.3.2.2 自填中性氧化鋁固相萃取柱(30 mL石油醚活化)[29]

三氧化二鋁的活化：稱取120 g三氧化二鋁置于坩堝并放入馬弗爐中，用450 ℃進(jìn)行灼燒，設(shè)置程序使其灼燒12 h，降至室溫后取出坩堝，將三氧化二鋁迅速轉(zhuǎn)入黑色的試劑瓶并加入10 mL水，劇烈振蕩15 min，將其避光靜置24 h。

樣品的處理：稱取0.4 g稻米油樣品，加入0.1 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，加入2 mL石油醚，渦旋混勻，待凈化。

三氧化二鋁的填柱：將玻璃層析柱用超純水洗滌3次后，再用無(wú)水乙醇洗滌3次，自然晾干。加入40 mL石油醚，打開(kāi)活塞，放出石油醚至管身的1/2處,旋緊活塞，加入22 g活化的三氧化二鋁和2 g無(wú)水硫酸鈉，再次打開(kāi)活塞，將石油醚放至無(wú)水硫酸鈉處旋緊活塞。上樣：將待凈化液全部轉(zhuǎn)入玻璃層析柱中，分離，純化。收集：加入80 mL石油醚進(jìn)行洗脫，棄去前20 mL石油醚，收集剩余的石油醚于45 ℃氮吹濃縮至近干，用流動(dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻，溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，并做空白實(shí)驗(yàn)，供液相色譜測(cè)定。

1.3.3.3 GPC體積排阻法[27, 30]

稱取混勻后的稻米油4.0 g置于50 mL聚丙烯離心管中，加入0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)母液，加入20 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷(1+1)，混勻振蕩提取15 min，取出5 mL樣液，供GPC色譜分離，收集樣液于45 ℃氮吹濃縮至近干，用流動(dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻，溶液經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，并做空白實(shí)驗(yàn)，供液相色譜測(cè)定。前處理過(guò)程比對(duì)如表1所示。

表1 同一樣品的不同前處理過(guò)程

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

毒黃素在258 nm處有最大吸收峰，路霉素在232 nm處有最大吸收峰，熱誠(chéng)菌素在238 nm處有最大吸收峰，通過(guò)對(duì)這3種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描來(lái)選擇最佳吸收波長(zhǎng)，如圖1所示，當(dāng)波長(zhǎng)為240 nm時(shí)，毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素有相對(duì)較高的吸光度，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選為240 nm；使用甲醇甲酸為流動(dòng)相時(shí)，可以使路霉素和毒黃素這兩個(gè)同時(shí)出峰的物質(zhì)達(dá)到相應(yīng)分離度要求，因此本研究選用0.1%甲酸-甲醇(90∶10)為流動(dòng)相。

圖1 毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

根據(jù)食用植物油的大分子特征和目標(biāo)化合物的性質(zhì)，采用了5種不同的的前處理提取方法。液液萃取法是利用不同目標(biāo)物質(zhì)在試劑中分配系數(shù)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離目的。采用有機(jī)試劑直接提取目標(biāo)物質(zhì)[31]，可以節(jié)省成本，同時(shí)降低其他雜質(zhì)干擾的風(fēng)險(xiǎn)?？紤]到食用植物油不溶于甲醇和乙腈，本研究結(jié)合油脂中化合物測(cè)定的相關(guān)國(guó)家檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，考察了幾種主要前處理方式。采用了甲醇[27]和正己烷飽和的乙腈[26]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提取溶液出現(xiàn)明顯顏色差異現(xiàn)象，經(jīng)甲醇提取的溶液顏色是深黃色，而正己烷飽和的乙腈是淡黃色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2種試劑的基質(zhì)干擾都很低，目標(biāo)物質(zhì)都能有效分離，區(qū)別在于甲醇溶液比正己烷飽和的乙腈溶液的回收率更高、更穩(wěn)定；本研究中固相萃取法是利用物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)的不同來(lái)達(dá)到分離[31]，采用極易溶解油脂的正己烷[28]和石油醚[29]溶液來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較商用固相萃取和自填柱對(duì)物質(zhì)分離效果的影響，除去植物油中其他雜質(zhì)的干擾，獲得更穩(wěn)定的基線。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，兩者填料柱里有明顯的黃色物質(zhì)。結(jié)果表明，洗脫液中未檢出3種目標(biāo)化合物，這可能是目標(biāo)物不溶于正己烷和石油醚，無(wú)法從填料柱中洗脫下來(lái)；采用GPC體積排阻法[30]是根據(jù)溶液中各物質(zhì)的分子質(zhì)量不同，經(jīng)過(guò)色譜柱后的停留時(shí)間各不一致來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，可知毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素均是小分子化合物，而樣品稻米油是大分子物質(zhì)，利用這一特性結(jié)合GPC的技術(shù)原理[31]，將雜質(zhì)和目標(biāo)化合物在柱前進(jìn)行分離，得到較為純凈的樣液，再進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)，可以減少樣品雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物出峰時(shí)間和分離情況的干擾，同時(shí)，減少樣品雜質(zhì)對(duì)色譜柱和檢測(cè)儀器的污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法的基質(zhì)干擾較低，目標(biāo)物質(zhì)可以有效分離，但是回收率效果不理想，可能是由于目標(biāo)物不易溶于流動(dòng)相造成的。結(jié)果如表2和圖2所示。最終選擇用液液萃取法中甲醇溶液直接提取，實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收和穩(wěn)定性均達(dá)到要求，相對(duì)其他前處理方法更為方便，能夠節(jié)約前處理的時(shí)間和成本。

表2 不同前處理方法的回收率

注：1為空白樣品，2為Al2O3固相萃取柱(30 mL正己烷活化)，3為自填中性氧化鋁固相萃取柱(30 mL石油醚活化)，4為GPC體積排阻法，5為液液萃取-乙腈飽和正己烷，6為液液萃取-甲醇。圖2 不同前處理方法的峰面積

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

分別以毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示3種目標(biāo)化合物在0～40.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。以信噪比(S/N)為3計(jì)算方法檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10計(jì)算方法定量限(LOQ)，本方法中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的LOD與LOQ分別為0.8 mg/kg與3.2 mg/kg，檢測(cè)靈敏度較高，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.3.2 回收率實(shí)驗(yàn)和精密度

稱5.0 g空白稻米油樣品于50 mL聚丙烯離心管中，分別添加3.2、6.4、32.0 mg/kg的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻后，按照樣品前處理方法進(jìn)行提取，進(jìn)高效液相色譜分析，將加標(biāo)后樣品中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的含量與加標(biāo)量相比計(jì)算回收率，毒黃素為98.93%～109.44%，路霉素為102.85%～109.77%，熱誠(chéng)菌素為95.26%～101.54%，數(shù)據(jù)表明樣品回收率良好，毒黃素方法精密度(RSD)小于6.81%，路霉素方法精密度(RSD)小于4.26%，熱誠(chéng)菌素方法精密度小于4.30%，結(jié)果顯示該方法精密度良好，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，表明本研究方法能準(zhǔn)確檢測(cè)食用植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素方法回收率和精密度(n=6)

2.3.3 日內(nèi)精密度和日間精密度

取40 μg/mL的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察本方法的日內(nèi)精密度；將該溶液連續(xù)3 d在相同的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，以考察本方法的日間精密度。毒黃素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別為0.068%與0.81%，其日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)分別為0.19%與1.21%，路霉素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別為0.13%與0.46%，，其日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)分別為0.18%與1.76%，熱誠(chéng)菌素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別為0.19%與0.42%，其日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)分別為0.33%與2.00%，表明該方法具有較好的日內(nèi)精密度與日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表5 毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的日內(nèi)精密度(n=6)

表6 毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的日間精密度(n=3)

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取市場(chǎng)上主要流通的食用植物油有菜籽油、稻米油、玉米油、芝麻油、花生油和大豆油等11個(gè)樣本，采用高效液相色譜分析測(cè)定植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素含量，結(jié)果顯示11種植物油均未檢出毒黃素(<0.8 mg/kg)，路霉素(<0.8 mg/kg)和熱誠(chéng)菌素(<0.8 mg/kg)。任意選取一稻米油稱取10個(gè)平行隨機(jī)添加3個(gè)試管中模擬盲樣測(cè)試，添加水平分別為4、8、32 mg/kg，結(jié)果顯示路霉素分別為4.02、7.74、31.18 mg/kg；毒黃素分別為4.13、7.84、30.22 mg/kg；熱誠(chéng)菌素分別為3.92、7.77、30.55 mg/kg，其他樣品均未檢出，說(shuō)明該方法可以準(zhǔn)確地定性和定量植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化，建立一種食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。該法在0～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，毒黃素：y=19.184x-6.00×10-9(r2=0.999 6)；路霉素：y=11.273x+3.12 (r2=0.999 4)；熱誠(chéng)菌素：y=29.129x-2.00×10-8(r2=0.999 5)。靈敏度高，當(dāng)取樣量為5 g時(shí)，樣品中的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素經(jīng)甲醇提取，以0.1甲酸∶甲醇(90∶10)為流動(dòng)相，在240 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。方法的檢出限均為0.8 mg/kg,定量限均為3.2 mg/kg；在食用植物油中進(jìn)行范圍為3.2～32 mg/kg加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，毒黃素的回收率(n=6)為102.85%～109.77%，方法精密度(RSD，n=6)小于6.81%；路霉素的回收率(n=6)為98.93%～109.44%， 方法精密度(RSD，n=6)小于4.26%；熱誠(chéng)菌素的回收率(n=6)為95.26%～101.54%, 方法的精密度(RSD，n=6)小于4.30%。本方法操作方便，準(zhǔn)確度高，可用于植物油中毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素的含量測(cè)定，也為其他食品中可能產(chǎn)生的毒黃素、路霉素和熱誠(chéng)菌素含量測(cè)定提供檢測(cè)依據(jù)。