蕓豆/大豆復合發(fā)酵液工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

李志芳， 張 裕， 王 穎,2,3， 佐兆杭， 孫 維， 張乃丹， 周欣雨

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1，大慶 163319) (國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室3，大慶 163319)

蕓豆，又名四季豆，在我國種植廣泛，已成為栽培面積僅次于黃豆的食用豆類農(nóng)作物[1]，富含蛋白質(zhì)、B族維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時含有多種人體必需氨基酸，且氨基酸比例較為均衡，是一種比較難得的高鉀、高鎂、低鈉食品[2]。蕓豆含有多種活性物質(zhì)，研究表明，蕓豆α-淀粉酶抑制劑可有效改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠高脂血癥、胰島素抵抗及抗氧化防御系統(tǒng)，降低機體氧化應激及血糖靈敏度[3，4]；蕓豆蛋白酶解成多肽后，不僅能夠提高營養(yǎng)價值，而且方便吸收，還具有抗氧化、降血壓、抗菌等多種功能活性[5]。

大豆，通稱黃豆，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素，其高含量的蛋白質(zhì)能夠提供潛在活性肽，可抑制與機體氧化應激相關的疾病，如冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病等[6]。大豆中的酚類化合物具有優(yōu)異的還原性能，能夠通過清除ROS來抑制脂質(zhì)過氧化而有效清除自由基，可作為抗氧化劑保護細胞[7，8]。發(fā)酵豆制品經(jīng)過微生物及其分泌的酶系作用后，把不溶性高分子物質(zhì)分解成可溶性低分子物質(zhì)，保留了大豆異黃酮和低聚糖等原有功能性物質(zhì)[9，10]，對于維持人類身體健康具有重要的營養(yǎng)價值。

蕓豆和大豆本身含有許多活性物質(zhì)，它們存在于各自的植物細胞中，其外層是由纖維素組成的細胞壁，機械方法能夠幫助破壞植物細胞，但是對于溶出或釋放活性物質(zhì)的效率不高，通過微生物的生化作用能有效解決這個問題。微生物通過發(fā)酵，能夠分泌多種酶并對植物細胞進行分解，從而有效地促進活性物質(zhì)的釋放[11]。同時，發(fā)酵原料經(jīng)過多種微生物共同發(fā)酵后，會使發(fā)酵液富含多種酶類，包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶等功效酶[12，13]，保護機體不受自由基損害的同時提高功能性化合物的活性[14]。目前開發(fā)的發(fā)酵豆類產(chǎn)品多以單一原料為主，復合發(fā)酵的研究相對較少，因此本研究選用蕓豆、大豆為復合發(fā)酵原料，探究其最佳發(fā)酵條件及抗氧化活性，旨在為開發(fā)新型復合發(fā)酵產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆、大豆；活性干酵母、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)；耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、羥自由基檢測試盒。

1.2 儀器與設備

JYL-Y912料理機；S220 pH計；H1850R冷凍離心機；BCV-6S1超凈工作臺；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；V-5100B可見分光光度計；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

菌種的活化與培養(yǎng)：乳酸菌活化時取10%液態(tài)保藏的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌液于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌液待用。酵母菌活化時活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，待用。

清汁的發(fā)酵：紫花蕓豆、大豆清洗后去皮，按1∶3料水質(zhì)量體積比打漿。雙酶法進行水解，液化條件為α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH=6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件為加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機中以1.0×104r/min離心15 min得清汁。調(diào)清汁pH 5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%后滅菌。冷卻后接種0.2%酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進行預發(fā)酵，按1∶1(共同發(fā)酵)比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌恒溫發(fā)酵24 h。4 ℃后發(fā)酵并保藏備用。

1.3.3 單因素實驗設計

清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后滅菌，接種3%復配乳酸菌，32 ℃發(fā)酵24 h(發(fā)酵時間由前期實驗優(yōu)化確定)，測定發(fā)酵液SOD活力。固定其他條件，分別考察糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度對SOD活力的影響，使用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒測定。

1.3.4 響應面實驗設計

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度4個單因素為自變量，以發(fā)酵液SOD活力為響應值，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.5 抗氧化實驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL樣品溶液與2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混勻，室溫下暗反應30 min，空白組以無水乙醇代替試樣，517 nm處測定樣品吸光度值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用無水乙醇代替DPPH時測得對應濃度的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除能力測定

使用羥自由基測試試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

由圖1所示，SOD活力隨糖添加量增加而升高，在糖添加量為6%時出現(xiàn)峰值，隨后有所下降，推測糖類作為菌種發(fā)酵最重要的碳源物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)糖濃度增大可能誘導細胞對胞內(nèi)主要代謝途徑的酶活力水平有所提升[15]，但是糖濃度過高會使發(fā)酵液滲透壓增高，造成細胞壁特性發(fā)生改變，使菌種生長周期停滯甚至凋亡[16]，影響發(fā)酵的正常進行。因此本實驗條件下確定最適糖添加量為6%。

由圖1所示，SOD活力隨初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢，初始pH為4時達到峰值，原因可是SOD化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)，其分子內(nèi)部規(guī)律性結構易受pH、溫度等物理或化學因素影響，導致氫鍵斷裂進而使空間結構遭到破壞[17]，使酶活性降低。

接種量的高低會影響發(fā)酵初期乳酸菌的生長速度，由圖可知，SOD活力隨接種量的增大而增大，但當接種量大于4%時，SOD活力呈下降趨勢，分析原因可能是當乳酸菌超過適宜接種量時，會縮短延滯期并很快到達對數(shù)生長期，體系的營養(yǎng)物質(zhì)在此階段易被迅速消耗掉[18]，不利于后期發(fā)酵的持續(xù)性進行，而接種量過低易污染雜菌不利于菌種生長增殖[19]，因此選用4%為最佳接種量以保證發(fā)酵過程的正常進行。

發(fā)酵溫度會影響微生物的生長代謝，進而影響發(fā)酵液中抗氧化物質(zhì)含量和活性[20]。由圖1所示，SOD活力隨著發(fā)酵溫度的升高逐漸增大，說明發(fā)酵溫度的升高有利于增強微生物的活性，可促進維生素C、酚類等抗氧化物質(zhì)的溶出或產(chǎn)生[21]，使體系抗氧化物質(zhì)含量增加而增強SOD活力，但是溫度過高就會抑制微生物中酶的活性，同時縮短發(fā)酵周期，影響微生物的正常生長代謝，從而使產(chǎn)生的SOD及各產(chǎn)物量變低。因此本實驗條件下選用32 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 單因素實驗結果

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 響應面實驗因素與水平設計

響應面實驗因素與水平設計表見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

2.2.2 響應面結果及分析

響應面設計各因素水平的復合發(fā)酵液SOD活力見表2。對表2實驗結果進行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=270.03+2.44A-2.20B+4.43C+0.64D-2.10AB-4.23AC+2.72AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.06A2-18.79B2-18.64C2-11.43D2。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 回歸方程方差分析及結果

2.2.3 交互作用分析

通過三維響應面和二維等高線圖分析可得，隨著糖添加量、初始pH、接種量和發(fā)酵溫度的增大，發(fā)酵液SOD活力隨之增大，但當4個因素增加到一定程度時，SOD活力呈下降趨勢，其中初始pH與接種量、發(fā)酵溫度兩因素交互作用等高線圖密集成橢圓形，說明兩因素交互作用顯著，由響應面圖對比可知，接種量和糖添加量曲面彎曲程度較大，表明其對發(fā)酵液SOD活力影響顯著，與方差分析結果相一致。經(jīng)Design Expert 8.0.6優(yōu)化復合發(fā)酵液工藝參數(shù)得：糖添加量6.10%，初始pH 3.98，接種量4.10%，發(fā)酵溫度32.07 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力預測值可達270.383 U/mL。考慮到實踐操作可行性，調(diào)整工藝參數(shù)為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，重復3次實驗得復合發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL(誤差0.61%)，與理論值基本吻合，證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準確性。

2.3 不同發(fā)酵階段復合發(fā)酵液抗氧化活性分析

2.3.1 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率變化

DPPH是一個以氮原子為中心的穩(wěn)定脂溶性自由基，是體外檢測物質(zhì)抗氧化效果最常用的一種方法，可在短時間內(nèi)較穩(wěn)定評價物質(zhì)抗氧化活性[22]。如圖2所示，整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液對DPPH自由基清除率呈先迅速上升后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵24 h時，DPPH自由基清除率迅速增長約2倍，隨后以小幅趨勢繼續(xù)增長，說明在適當發(fā)酵時間內(nèi)，發(fā)酵液DPPH自由基清除能力會隨發(fā)酵時間的延長而有所提高，至發(fā)酵結束可達90.72%，分析原因可能與發(fā)酵過程釋放的酚類、黃酮物質(zhì)有關，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生如超氧化物歧化酶等抗氧化酶，它們共同作用可提高DPPH自由基清除率。

圖2 發(fā)酵過程中DPPH、羥自由基清除能力的變化

2.3.2 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化

羥自由基是一種重要的活性氧，是人體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，它可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導致細胞壞死或突變[23]。如圖2所示，羥基自由基的清除能力隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，發(fā)酵結束時清除能力增長至606.26 U/mL，約為發(fā)酵初始值的2倍。羥基自由基清除能力的提高可能是由于發(fā)酵液中有機酸、大豆多酚等包含有自由羥基的酚類物質(zhì)，能提供活潑的氫終止自由基連鎖反應。同時，發(fā)酵能夠將大分子蛋白分解為末端氨基酸殘基具有抗氧化活性的小分子多肽[24]，增強體系抗氧化能力。

3 結論

通過對蕓豆/大豆復合發(fā)酵液工藝參數(shù)優(yōu)化及功能性分析，結果表明：復合發(fā)酵液最優(yōu)工藝條件為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL。復合發(fā)酵液DPPH自由基清除率及羥自由基清除率能力顯著增長，至發(fā)酵結束其清除能力分別為90.72%和606.26 U/mL，證明經(jīng)工藝優(yōu)化后的發(fā)酵液具有良好的抗氧化活性。