6種植物精油對玉米中霉菌的抑菌作用

代安娜, 張麗媛,2, 錢麗麗,2

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室2，大慶 163319)

玉米作為我國三大主糧之一，在收儲過程易受到曲霉屬和青霉屬的侵染而產生霉變[1，2]。糧食在儲藏過程中的霉變程度與含水率、溫度和濕度密切相關[3，4]。此外在糧食儲運過程中，添加防霉劑是防止霉變的有效手段之一，常用防霉劑是臭氧、磷化鋁熏蒸及有機酸，但有化學毒性殘留；造成環境二次污染和易使糧食中真菌產生抗性的缺點[5]。

植物精油(EOs)是從植物花、葉、果實等部位提取的植物次生代謝產物[6]。一般由醇類、酸類和酚類組成，作用機理復雜，難使病原菌產生抗性[7，8]，可作為一種天然提取物防腐劑[9，10]。目前開發利用的約300余種[11，12]，Prakash等[13]發現葛縷子精油可顯著減少黃曲霉毒素的產生。Prieto等[14]發現萬壽菊精油和百里香精油可有效抑制馬鈴薯赤霉病[14]，Ghabraie等[15]發現32種精油對4種致病菌和銅綠假單胞菌具有良好的抗菌活性[15]。此外也有研究表明黃曲霉、灰綠曲霉及青霉對丁香精油屬于高度敏感[16]，黑曲霉對八角茴香精油屬于中度敏感，對薄荷精油屬于低度敏感[17，18]。此外有研究將肉桂、花椒、八角茴香精油復配發現能有效抑制從紅提葡萄中分離的青霉菌、黑根霉及黑曲霉菌的生長[19]。此外將肉桂醛、檸檬醛、丁香酚和薄荷醇復合應用在玉米儲藏上，可有效抑制黃曲霉生長，同時該精油復合物對霉菌抑制率(89%)，大于丙酸處理組(71.7%)[5]。而陳光勇等[20]將肉桂醛和百里香酚復合后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果優于山梨酸、苯甲酸、檸檬酸、丁酸鈉和丁酸甘油酯[20]。此外，與有機酸和丁酸類物質相比，植物精油主要從天然植物的活性部位提取，來源天然，具有無毒、較強的抑菌性和環境友好的優點，在抑制霉菌生長及毒素產生方面效果理想，是潛在用于玉米防霉，達到防止其霉變的有效物質。而目前大多是研究單種植物精油抑制果蔬霉菌和致病菌，肉制品細菌生長和玉米及稻谷中某些霉菌生長，很少研制復合植物精油防止玉米及儲糧發生霉變。因此本實驗選擇6種植物精油，研究對玉米中分離的霉菌的抑制作用，為開發一種天然儲糧防霉劑，減少經濟損失和保護消費者健康等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精油：薄荷精油、丁香精油、八角茴香精油、花椒精油、大蒜精油、橙皮精油。

干玉米粒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、孟加拉紅培養基、氯化鎂(分析純)、硝酸鈉(分析純)、丙酸(分析純)。

1.2 儀器與設備

LDZM-802KCS立式高壓蒸汽滅菌器，MJP-80型霉菌培養箱，SCB-1360型超凈工作臺，DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，THZ-82A水浴恒溫振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 分離鑒定霉菌

1.3.1.1 玉米培養基及飽和鹽溶液

玉米培養基：采用含水量為20%和50%，稱取25 g干玉米粒平鋪到平皿，于121 ℃高壓滅菌15 min，向上述平皿內加入1.3倍理論添加水量的滅菌蒸餾水，并于4 ℃冰箱內放置2 d(每隔6 h搖動1次)，以便充分吸濕后達到平衡水分含量[21]。

飽和鹽溶液：無菌操作下向燒杯加入100 mL滅菌去離子水，并分別加入適量氯化鎂和硝酸鈉以形成實驗所需的相對濕度為30%和70%的環境，將燒杯用保鮮膜密封后，并在下一步實驗所需溫度的恒溫培養箱中放置2 d。

從冰箱中取出按上述操作制備好的不同水分含量的玉米培養基平皿，將平皿置于含有飽和鹽溶液的燒杯內，每個燒杯中放置1個含玉米培養基的平皿，并將燒杯用保鮮膜密封后，分別于30 ℃和35 ℃條件下儲藏，并分別對儲藏2、4、6、8、10 d的玉米培養基中的優勢霉菌進行分離培養。

1.3.1.2 霉菌分離和鑒定

無菌條件下，將按1.3.1.1步驟儲藏的玉米培養基放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩20 min，進行梯度稀釋至合適濃度，取1 mL稀釋樣品到PDA培養基上，無菌涂布棒涂布均勻，28 ℃培養3～5 d，接種針挑取疑似霉菌菌落，在孟加拉紅培養基上做劃線分離，28 ℃純種培養3代以上后，接種于PDA培養基內，于某公司鑒定菌株。

1.3.2 制備孢懸液

挑取純種培養三代以上的的霉菌菌落，28 ℃培養72 h，平皿內加少許滅菌水，無菌涂布棒刮取孢子，滅菌水進行10倍稀釋，并用血球計數板計數，制成濃度為3.0～6.0×106CFU/mL的孢懸液。

1.3.3 體外抑菌實驗

采用濾紙片法測定植物精油的體外抑菌活性[22]。在超凈工作臺中向滅菌干燥后的培養皿(直徑90 mm)中倒入約20 mL PDA培養基，待冷卻凝固。吸取100 μL孢懸液到培養基表面，無菌涂布棒涂布均勻。

選用吸水性強的定性濾紙，用打孔器制作成小圓片(直徑6 mm)，121 ℃高壓滅菌烘干后，吸取10 μL精油滴加到干燥后的濾紙片上，用無菌鑷子將濾紙片貼在培養基上壓緊，每個培養皿上貼3片濾紙片做平行實驗(3片濾紙片呈三角狀排列且相距一定的距離)，重復3次實驗，同時以不做處理的空白培養基為對照，丙酸處理的培養基作為對照組，28 ℃培養72 h，測量抑菌圈的直徑，取3次結果平均值記錄數據。根據抑菌圈直徑的大小來判斷結果[23]，抑菌圈>15 mm為高度敏感，10 mm<抑菌圈<15 mm時為中度敏感，7 mm<抑菌圈<9 mm時為低度敏感，抑菌圈=0 mm為不敏感。

根據單種精油抑菌實驗及后續的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的實驗結果，選擇綜合抑菌效果好的四種精油進行復合，并吸取10 μL復合精油滴加到干燥后的濾紙片上后，在培養皿的中央放置1片濾紙片，其他操作步驟相同，28 ℃培養72 h，測量抑菌圈的直徑，重復3次實驗。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

根據單種精油抑菌實驗結果，選擇5株霉菌表現為高度敏感的精油利用含毒介質法進行MIC和MBC的測定[24，25]。將精油用95%乙醇分別梯度稀釋到50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL。在無菌培養皿中加人100 μL孢懸液和100 μL梯度稀釋的精油，倒入20 mL未凝固PDA培養基，充分混合。每組3皿，28 ℃培養。實驗中以95%乙醇和無菌水為對照。48 h后，觀察測試菌種的生長情況，以完全沒有菌落生長的最低濃度作為該精油的最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.5 最小殺菌濃度(MBC)的測定

取2.3.4沒有長菌的平皿繼續培養48 h后，取出觀察以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的最小殺菌濃度(MBC)。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel和SPSS 22.0軟件對實驗數據進行處理和方差分析。

2 結果分析

2.1 分離鑒別霉菌結果

在含水量為20%的玉米樣品，放置時間在2～8 d均出現黑色的菌落，在放置6 d時只有黑色菌落出現，在放置4 d出現綠色的菌落。含水量為50%的玉米樣品，放置時間在2～8 d均有黑色的菌落和黃色菌落產生，在放置第4 d時出現不同于水分含量為20%的深綠色菌落。

如圖1和圖2所示，將分離得到的5株優勢菌株進行PCR擴增，同時獲得的ITS序列在NCBI中進行BLAST對比，5株菌株分別與Aspergillusniger(黑曲霉，MH511143.1)、Penicilliumchrysogenum(產黃青霉，MT141145.1)、Aspergillusflavus(黃曲霉，MT645322.1)、Aspergillusversicolor(雜色曲霉，MN416222.1)和Penicilliumexpansum(青霉，MK850332.1)同源性最高，相似度達到100%。黑曲霉生長快速，在糧食、植物及土壤中均可發現，極易通過空氣進行擴散，尤其是糧食水分含量高時易引起霉變。黃曲霉易在發霉的玉米和花生中發現，可以產生黃曲霉毒素危害人類及牲畜的健康。雜色曲霉產生雜色曲霉素(ST)普遍污染大米、玉米和小麥。青霉菌常見于變質的果蔬、肉食和衣服上和糧食中，大多數為灰綠色，包括能夠產生青霉素的產黃青霉。

圖1 玉米中分離的霉菌

圖2 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 單種精油抑菌結果

圖3表示6種精油對這5種霉菌均具有一定的抑菌作用，其中丁香精油和大蒜精油的抑菌作用最明顯、可以看到出現很明顯的抑菌圈。薄荷、花椒和八角茴香精油對除黑曲霉外的霉菌表現出一定的抑制作用，橙皮精油對除黑曲霉和黃曲霉外的霉菌表現出一定的抑制作用。

注：a花椒精油；b丁香精油；c八角精油；d薄荷精油；e大蒜精油；f橙皮精油。圖3 單種精油對霉菌的抑菌效果

由表1可知，黑曲霉對丁香精油高度敏感；對大蒜精油中度敏感；對花椒、八角茴香、橙皮、薄荷精油不敏感；雜色曲霉對花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，對薄荷、大蒜、橙皮精油中度敏感；青霉菌對丁香、花椒、大蒜、薄荷、八角茴香精油高度敏感，對橙皮精油中度敏感；產黃青霉對丁香、大蒜精油高度敏感，對花椒、八角茴香、薄荷、橙皮精油中度敏感；黃曲霉對花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，對薄荷、大蒜精油中度敏感，對橙皮精油不敏感。同時上述霉菌對丙酸處理組均為高度敏感。

表1 單種精油對霉菌的抑菌圈直徑

通過對單種精油抑菌結果的分析，丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸對5種玉米霉菌效果較好，但大蒜精油味道重且較難去除，會影響玉米的后續加工，而丙酸具有強烈刺激性氣味，對皮膚有刺激性，對容器、加工設備也有腐蝕性，因此不選擇大蒜精油和丙酸，而選擇丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油進行復合，并進行抑菌實驗，這四種精油及丙酸的綜合抑菌能力大小依次為丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，而且丁香精油和花椒精油的抑菌效果優于八角茴香和薄荷精油，因此選擇這四種精油以MBC為精油濃度進行復合，得到復合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=1∶1∶1∶1)和復合精油2(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=2∶2∶1∶1)。

2.3 MIC的測定結果

精油MIC測定結果如表2所示。丁香精油對黑曲霉、雜色曲霉、青霉和產黃青霉的MIC為12.5μL/mL，對黃曲霉的的MIC為25 μL/mL。八角茴香對雜色曲霉和黃曲霉的MIC為25 μL/mL，對青霉的MIC為12.5 μL/mL。花椒精油對青霉的MIC為12.5 μL/mL。大蒜精油對青霉的MIC為3.125μL/mL，對產黃青霉的MIC為12.5 μL/mL。薄荷精油對青霉的MIC為25 μL/mL。

表2 精油對5種霉菌的MIC測定

2.4 MBC的測定結果

精油對5株霉菌的MBC的測定結果如表3所示。丁香精油對黑曲霉和青霉的MBC為25 μL/mL、對雜色曲霉MBC為12.5 μL/mL，對產黃青霉和黃曲霉的的MBC為50 μL/mL。八角茴香對雜色曲霉和黃曲霉的MBC為50 μL/mL，對青霉的MBC為12.5 μL/mL。大蒜精油對青霉的MBC為12.5 μL/mL，對產黃青霉的MBC為25 μL/mL。薄荷精油對青霉的MBC為50 μL/mL。

表3 精油對5種霉菌的MBC測定

2.5 復合精油抑菌實驗結果

復合精油1和復合精油2對5種霉菌表現出明顯的抑制作用，尤其是對青霉菌，在培養基上沒有明顯的菌落生長；對產黃青霉，黑曲霉，黃曲霉和雜色曲表現一定的抑制作用，有較少的菌落出現在培養基上。同時由表4可知，5種霉菌均對復合精油1和復合精油2為高度敏感。抑菌能力大小依次為青霉菌>黃曲霉>產黃青霉>黑曲霉>雜色曲霉。而且復合精油對青霉的抑菌效果最佳，且這兩個復合精油抑菌效果基本相近，但精油抑菌成本較高，考慮到經濟原因，因此選擇等體積比復合丁香，花椒，八角茴香，薄荷精油開發玉米防霉劑。

表4 復合植物精油對霉菌抑菌圈直徑

2.6 復合精油與單種精油實驗結果對比分析

將上述實驗所得到的復合精油1和復合精油2與單種精油抑菌圈判定的敏感度進行比對，由表5可發現5種霉菌對復合精油1和復合精油2的敏感度均為高度敏感，且均高于霉菌對單種精油的敏感度。由于精油經過一定體積比的復合后可以起到協同增效的作用[26]，因此得到比單種精油更好的抑菌效果。

表5 復合植物精油與單種植物精油抑菌效果比較

3 結論

通過研究丁香，花椒，薄荷，八角茴香，大蒜，橙皮精油對黑曲霉、黃曲霉、雜色曲霉、青霉菌、產黃青霉的抑菌效果，發現丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸對上述霉菌抑菌作用明顯，且抑菌能力大小依次為丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，但大蒜精油味道重且較難去除，丙酸對皮膚有刺激性，對容器、加工設備有腐蝕性，因此選擇丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油進行復合精油抑菌實驗。同時通過霉菌對相同劑量的單種植物精油和復合植物精油敏感程度的結果進行比對，得出復合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=1∶1∶1∶1)對黑曲霉、雜色曲霉、青霉菌、產黃青霉、黃曲霉的抑菌效果均比單種精油的抑菌作用明顯。可為復合植物精油作為玉米及儲糧天然防霉劑的研究提供參考。