毛梾籽油結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織生化指標的影響

劉 鵬, 周松峰, 房 磊

(吉林化工學院1，吉林 132022) (吉林農業科技學院2，吉林 132101)

毛梾(Cornuswalteri)是一種山茱萸科的落葉喬木，毛梾又稱梁木、油樹，在我國的分布較為廣泛，常分布于山西、河北以及長江以南等區域[1]。隨著對其化學成分的研究，毛梾的藥用價值進入研究人員視野，逐漸引起人們關注[2]。毛梾的果子可做酒，并且根、果均可入藥，毛梾種子含油率為36%～38%，毛梾籽油屬半干性油，其中含有硬脂酸1.6%，十六碳烯酸3.2%、油酸33.6%、亞油酸38%[3，4]。

在食用方面，毛梾籽油在我國進行食用已經延續百年時間了，在主要油料地區當地居民將其作為食用油進行食用，并且具有無化肥農藥、天然健康、不飽和脂肪酸含量高等特點[5]。毛梾籽油的食用價值已經遠高于花生和大豆，當前我國已經將毛梾籽油列為食品商用油，其具有極高的藥用價值和營養價值[6]。并且具備降低血脂、血壓，起到治療心血管疾病的作用，如冠心病、高血壓等[7]。同時毛梾籽油具有較強的抗氧化作用，其含有的黃酮類物質具備較好的熱穩定性，具有清除自由基的能力[8]。鑒于毛梾籽油的營養價值較高，及具有較強的抗氧化能力，本文采用響應面優化提取毛梾籽油，并且結合有氧運動設計實驗，研究對脂肪肝大鼠肝組織生化指標的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛梾籽，市售；正己烷(分析純)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)，谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)；高脂飼料(包括15%豬油、3%膽固醇、2%魚肝油、80%基礎飼料)。

DX-30B型粉碎機、SA224S-CW型電子天平、GT SONIC-D3型超聲波清洗機、TG-29G型離心機、DHG-9035AE型鼓風干燥箱，DZKW-D-2型恒溫水浴鍋。

1.2 實驗動物及倫理要求

SPF級雄性SD大鼠50只，體重(150±5) g，許可證(SYXK(粵)2020-0240)。

在實驗中根據動物實驗的倫理要求，規范實驗人員倫理行為的操作規程，充分考慮動物的利益，善待動物，減輕或減少動物的應激、疼痛和傷害，尊重動物生命，制止針對動物的野蠻行為、采取痛苦最少的方法處置動物，減少動物不必要的處死和處死的數量。

1.3 方法

1.3.1 毛梾籽油的提取

將毛梾籽用清水洗凈，放置于干燥箱內，在60 ℃干燥2 h，粉碎，過80目篩，備用。稱取10 g毛梾籽粉末，放置于燒瓶中，加入50 mL的正己烷，將其放置在超聲波清洗器中，在一定超聲功率、提取溫度、提取時間下進行提取，提取結束后，減壓蒸餾出提取溶劑，并在50 ℃下干燥至恒重得到毛梾籽油[9，10]。

Y=(m/M)×100%

式中：Y為毛梾籽油得率/%；m為毛梾籽油質量/g；M為毛梾籽粉末質量/g。

1.3.2 毛梾籽油精煉

精煉：1)脫膠：將毛梾籽油放入燒杯中，將其放入恒溫水浴鍋中，溫度設置到50 ℃，保溫60 min，加入100 mL的蒸餾水，之后攪拌15 min，靜置存放2 h，使油脂與膠質分離，取上層油脂。2)堿煉：取脫膠的毛梾籽油，放入燒杯中，加入1mol/L KOH，并且不斷攪拌，保證混合均勻，靜置2 h后離心，取上層油脂。3)脫色：取脫膠堿煉的毛梾籽油，加入活性白土脫色，加入量為毛梾籽油質量的5%，攪拌1 h，離心分離，取上層油脂。最后，得到精煉的毛梾籽油。

1.4 單因素實驗

在提取溫度50 ℃，提取時間60 min，設定不同超聲功率200、250、300、350、400 W；在超聲功率350 W，提取時間60 min，設定不同提取溫度30、40、50、60、70 ℃；在超聲功率350 W，提取溫度50 ℃，設定不同提取時間40、50、60、70、80 min，研究對毛梾籽油得率的影響。

1.5 響應面法優化毛梾籽油提取工藝

在單因素實驗的基礎上，以毛梾籽油得率(Y)為指標，選擇超聲功率(X1)、提取溫度(X2) 、提取時間(X3)為因素，進行響應面實驗設計，實驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平

1.6 動物分組及運動方案

選取SPF級雄性SD大鼠50只，體重在(150±5) g，分成5個小組，每組10只大鼠，將其分為對照組A、模型組B、有氧運動組C、毛梾籽油組D、毛梾籽油結合有氧運動組E。

A組每天喂養普通飼料，其他4組喂養高脂飼料，大鼠正常飲水，實驗總共6周。建模2周時，除A組外其余4組喂養高脂飼料，大鼠體重增加，建立脂肪肝模型。第3周開始，C組開始進行游泳運動20 min，之后每周逐步遞增5 min；D組對其進行灌胃1 mg/g的毛梾籽油； E組在按照C組進行游泳運動之外，每天灌胃1 mg/g的毛梾籽油，并觀察每天大鼠的變化。6周實驗結束后，將大鼠麻醉，取腹部腹主動脈取血，4 ℃以下4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，測血清AST、ALT水平。在大鼠肝部邊緣1 cm處切取一小塊肝組織，在4 ℃條件下，稱取0.2 g肝組織，加入預冷后的生理鹽水至總體積2 mL，制備10%肝組織勻漿，以3 500 r/min，離心10 min，取上清液測試肝組織SOD、MDA、GSH-Px水平[11，12]。

1.7 統計學分析

本文使用SPSS 18.0軟件進行數據分析，數據均使用均值±標準差來表示，采取組間進行對比，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率、提取溫度、提取時間對毛梾籽油得率的影響

由圖1可知，隨著超聲功率的增加，毛梾籽油得率先上升后下降，當超聲功率為350 W時得率達到最高。主要因為超聲功率增加可以使空化作用增加，使得毛梾籽內的細胞破碎速度加快，使得油脂更容易析出。因此，選擇最佳超聲功率為350 W。

圖1 超聲功率、提取溫度、提取時間對毛梾籽油得率的影響

隨著溫度的升高，毛梾籽油得率先上升后下降，當提取溫度為50 ℃時，得率達到最高。這是因為溫度的升高，油脂會更容易析出到提取溶劑中，同時溫度過高會導致提取溶劑正己烷揮發，得率降低。因此，最佳提取溫度為50 ℃。

隨著提取時間的延長，毛梾籽油得率逐漸升高，當提取時間為60 min時得率幾乎不變。考慮到實驗成本以及經濟效益，選擇最佳提取時間為60 min。

2.2 響應面法實驗結果與分析

在單因素實驗的基礎上，確定各因素最佳水平值范圍，采用響應面法實驗設計，以毛梾籽油得率(Y)為指標，設計Box-Benhnken實驗中心組合實驗。響應面分析方案與結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

通過表2分析響應面結果可知，采用Design-Expert軟件對表3組實驗數據進行多元回歸擬合，建立回歸模型，以毛梾籽油得率為響應值，得到多元回歸方程：

Y=37.25+0.61X1+0.93X2+0.87X3-0.11X1X2-0.053X1X3-0.077X2X3-1.59X12-1.90X22-0.89X32

由表3分析可知：模型P=0.000 1<0.01，失擬項P=0.842 8>0.05，該模型擬合良好，實驗誤差小，R2=0.999 6，Adj.R2=0.999 0也表明模型擬合程度較好，實驗精度和重復性較好，適用于優化毛梾籽油提取工藝。

表3 響應面回歸模型ANOVA分析結果

此外，超聲功率、提取溫度、提取時間影響都達到了極顯著水平(P<0.01)，X1X2達到極顯著水平(P<0.01)、X2X3達到顯著水平(P<0.05)，超聲功率、提取溫度、提取時間各因素的二次項對得率影響極顯著(P<0.01)。

通過分析可知，毛梾籽油提取的最佳條件，超聲功率為358.74 W、提取溫度為52.30 ℃、提取時間為64.72 min、時毛梾籽油的得率為37.62%。考慮日后的實際操作便利，將提取工藝參數修正，超聲功率為360 W、提取溫度為52 ℃、提取時間為65 min。選取修正后的工藝參數組合做3次平行實驗，得出毛梾籽油的平均得率為37.36%，與預測值接近。因此修改的工藝參數具備實用價值。

2.3 毛梾籽油結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織SOD、GSH-Px 、MDA的影響

從表4得出，B組大鼠SOD水平與A組相比明顯降低(P<0.05)，E組大鼠SOD水平與B組相比明顯升高(P<0.05)，E組大鼠SOD水平與A組相比不具有顯著性差異(P>0.05)；B組大鼠GSH-Px水平與A組相比明顯降低(P<0.05)，E組大鼠GSH-Px水平與B組相比明顯升高(P<0.05)，E組大鼠GSH-Px水平與A組相比不具有顯著性差異(P>0.05)；B組大鼠MDA水平與A組相比明顯升高(P<0.05)，E組大鼠MDA水平與B組相比明顯降低(P<0.05)，E組大鼠MDA水平與A組相比不具有顯著性差異(P>0.05)。大鼠喂養高脂飼料建立脂肪肝模型使得肝細胞組織中的SOD和GSH-Px活性顯著降低，脂質過氧化產物MDA含量顯著增高，脂質過氧化產物具有細胞毒性，可以對肝細胞造成損傷。有氧運動訓練可以提高機體的抗氧化酶系統的能力，可以使機體自由基代謝能力加強，同時提高了氧運輸系統的能力，使得肝組織相對缺氧程度變小，進而使抗氧化系統得以增強，可以更有效的清除產生的自由基。脂肪肝模型大鼠體內存在著氧自由基蓄積和氧化應激反應，并且在脂肪肝及其并發癥的發生起到重要作用。由于毛梾籽油含有黃酮類物質具有較強的抗氧化能力，可以清除大量自由基，使MDA含量降低，恢復SOD和GSH-Px的活性，同時結合有氧運動可以對脂肪肝大鼠的氧自由基蓄積和氧化應激反應起到緩解作用，并且兩者結合的效果要優于單一效果。

表4 毛梾籽油結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織SOD、GSH-Px 、MDA的影響

2.4 毛梾籽油結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織ALT與AST的影響

從表5得出，B組大鼠ALT水平與A組相比明顯升高(P<0.05)，E組大鼠ALT水平與B組相比明顯降低(P<0.05)，E組大鼠ALT水平與A組相比不具有顯著性差異(P>0.05)；B組大鼠AST水平與A組相比明顯升高(P<0.05)，E組大鼠AST水平與B組相比明顯降低(P<0.05)，E組大鼠AST水平與A組相比不具有顯著性差異(P>0.05)。ALT、AST常用來反映肝功能具有代表性的檢測指標，同時也是肝功能損傷的檢測指標。ALT主要存在肝細胞漿中，一旦肝細胞出現壞死或者損傷，ALT水平就會升高，而AST主要存在于肝細胞的線粒體內，同樣如果肝細胞發生損傷或者壞死，AST水平也會升高。大鼠建立脂肪肝模型使得肝組織內的細胞出現損傷，導致ALT與AST水平升高。灌胃毛梾籽油后，并且結合有氧運動，使得ALT與AST水平下降，肝功能逐漸得到恢復，肝損傷得到緩解，并且兩者結合的效果要優于單一效果。

表5 毛梾籽油結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織ALT與AST的影響

3 結論

本研究以毛梾籽為主要原料，采用超聲波輔助法提取毛梾籽油，利用單因素和響應面實驗優化提取毛梾籽油工藝，結合實際操作，將提取工藝參數修正為，超聲功率為360 W、提取溫度為52 ℃、提取時間為65 min。得出毛梾籽油的平均得率為37.36%，與預測值接近。因此修改的工藝參數具備實用價值。同時研究其結合有氧運動對脂肪肝大鼠肝組織生化指標的影響，結果表明，毛梾籽油含有黃酮類物質具有較強的抗氧化能力，可以清除大量自由基，使MDA含量降低，恢復SOD和GSH-Px的活性，并且毛梾籽油和有氧運動單獨作用都可以對脂肪肝大鼠的氧自由基蓄積和氧化應激反應起到緩解作用，使得ALT與AST水平下降，肝功能逐漸得到恢復，肝損傷得到緩解，并且毛梾籽油結合有氧運動的效果要優于兩者單獨作用。