MICA基因標簽SNP檢測用于結直腸癌的關聯分析*

孫長江，丁偉峰

1.南通大學公共衛生學院，江蘇南通 226001；2.南通大學附屬醫院醫學檢驗科，江蘇南通 226001

結直腸癌(CRC)是常見的消化系統惡性腫瘤[1]，美國等國家CRC死亡人數占癌癥死亡人數的10%，僅次于肺癌，位居第2位[2]。2017年中國腫瘤登記年報顯示，我國城市CRC的發病率居惡性腫瘤第3位，并且與城市化程度相關，中國疾病預防控制中心統計的死亡人數與因癌死亡人數的比例超過10%，CRC防治形勢依舊嚴峻[3]。

有研究發現，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、SMAD4、BMPR1A、PTEN、STK11/LKB1、MYH等基因的單核苷酸多態性(SNP)及位點突變等遺傳變異可導致CRC[4-7]。然而，這些位于人類主要組織相容性抗原以外的基因變異，不足以完全解釋CRC的發病機制。主要組織相容性復合體Ⅰ類相關基因(MIC)家族包括MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF和MICG共7個成員，其中僅MICA和MICB基因編碼蛋白質。MICA基因位于人第6號染色體6p21.31，全長11 772 bp，cDNA長1 382 bp，編碼383個氨基酸殘基[8-9]。MICA與其受體自然殺傷細胞的活化型受體(NKG2D)相互作用，共同組成免疫監視系統[8,10]。MICA基因具有高度多態性，目前已發現224種MICA等位基因(截至2020年9月的數據)，共編碼104種不同的蛋白質[11-13]。MICA基因的高度多態性及其在不同種族、不同人群的遺傳異質性決定了其具有不同的標簽單核苷酸多態性(TagSNP)。

有研究發現，MICA基因多態性與強直性脊柱炎、貝赫切特綜合征、干燥綜合征等自身免疫性疾病密切相關[8,11-12]。但MICA基因多態性與CRC等實體瘤的遺傳免疫因素是否相關尚不清楚。因此，本文旨在研究CRC與MICA基因的TagSNP遺傳免疫相關因素，探討MICA基因的TagSNP用于連鎖分析CRC的可行性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2017年6月南通大學附屬醫院胃腸外科收治的104例散發性CRC患者作為CRC組，其中，男81例，女32例，平均年齡(66.1±10.1)歲。術中留取腫瘤組織及癌旁組織標本，采用無菌生理鹽水清洗后于-80 ℃冰箱保存。536例健康對照(健康對照組)標本來自復旦大學遺傳學研究項目隊列[8,13]。本研究由南通大學附屬醫院倫理委員會審核并全程監督。

1.2Sanger測序法檢測CRC組織中MICA外顯子2～5區基因多態性 設計MICA外顯子2～3區和4～5區的PCR擴增引物，采用Gel Extraction Kit(TianGen公司)抽提外周血或組織DNA，以全基因組DNA為模板，高保真擴增MICA外顯子2～5區序列，并對PCR產物進行Sanger測序。25 μL PCR反應體系(TaKaRa公司)：0.2 μg DNA模板，1×PCR反應緩沖液，200 μmol/L dNTPs，上、下游引物各0.2 μmol/L，Hotstar DNA聚合酶2.5 U。95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。收集PCR產物。上機測序：采用ABI PRISM?BigDye?Termintor v3.1 cycle Sequencing Kit(Illumina公司)試劑及ABI 3730測序儀(ABI公司)進行測序。

1.3SNP數據分析與處理 通過數據庫篩選候選MICA基因的TagSNP位點，使用Haploview軟件進行TagSNP數據的鑒定與分析，根據block選擇TagSNP，設置條件為少見等位基因頻率(MAF)≥0.05，r2>0.5。采用自動分析系統比對SNP數據，再采用Chromas分析軟件進行SNP數據的二次人工比對以保證雜合子結果的準確性。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0統計學軟件對數據進行處理。以P<0.1為差異有臨界統計學意義，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1篩選候選MICA的TagSNP位點 通過人類主要組織相容性抗原網站(http://www.ebi.au.uk/imgt/hla)，篩選MICA的SNP位點，結果發現，MICA基因外顯子2～5區分布有83種SNP位點。其中后續分析中篩選出的29種MICA基因的SNP位點為候選TagSNP。

2.2候選MICA基因TagSNP在CRC組中的連鎖性 根據104例CRC組的SNP情況，從MICA基因外顯子2～5區篩選出29種TagSNP，位于1個block中。29種TagSNP的連鎖不平衡性(LD)=1的TagSNP占95.3%，LD>0.8的TagSNP占96.5%；無連鎖TagSNP僅占2.9%，包括rs9380254、rs1051785、rs1063632和rs1051790；說明MICA基因外顯子2～5區各TagSNP間強連鎖。

2.3候選MICA基因TagSNP在健康對照組中的連鎖性 通過對536例健康對照組標本的Haploview檢測，發現29種TagSNP的LD=1的SNP占90.6%，LD>0.8的SNP占91.8%，0

2.4候選MICA基因TagSNP在千人基因組的連鎖性 從HapMap數據庫(map.org)下載千人基因組MICA基因的SNP數據，使用Haploview軟件，根據Hardy-Weinberge平衡，計算出MICA基因的TagSNP，結果顯示，rs9380254在千人基因組中與rs1063630等其他SNP基本無連鎖，二者位于不同的block。剩余28種TagSNP中，LD=1的SNP占86.9%，無連鎖TagSNP占13.1%，包括rs41554412、rs61738275、rs1063630、rs1051790、rs1051785、rs1063632、rs3819268。說明相對于中國人群，千人基因組人群MICA基因外顯子2～5區各TagSNP間連鎖不平衡更弱。

2.5MICA基因候選SNP在CRC組與健康對照組中的差異 通過連鎖不平衡分析發現，TagSNP在中國人群的CRC組、健康對照組及千人基因組有區別，篩選7種MICA基因顯著性差異的SNP位點，進一步比較發現，這些顯著性差異SNP位點在104例CRC組與536例健康對照組中的差異有臨界統計學意義(P<0.1)。見表1。

表1 MICA基因7種顯著性差異SNP位點

3 討 論

CRC的一個基本特征是基因或表觀遺傳的不穩定性。基因或表觀遺傳的不穩定可以鑒別腫瘤新生物與正常的大腸上皮[14-16]。研究發現，CRC相關的基因或表觀遺傳學分子病理學機制主要包括：(1)染色體不穩定(CIN)；(2)微衛星不穩定(MSI)；(3)非MSI的超突變；(4)異常的DNA甲基化及全DNA的去甲基化[17]。深入探討CRC分子病理學機制有利于其早期診斷及預防性治療[18]。

健康人MICA蛋白僅微量表達于腸道上皮，當感染、應激或惡性轉化時其表達可明顯上調，如卵巢癌、肝癌。MICA表達量與腫瘤發展水平及腫瘤浸潤程度有一定關聯：癌癥早期MICA表達量低，彌漫型腫瘤時表達量增高。MICA蛋白在體內有可溶性MICA(sMICA)和膜型MICA(mMICA)兩種形式[19]，研究發現，sMICA是腫瘤細胞死亡時由MICA分泌和金屬蛋白酶水解脫落到外周血的MICA[20]。釋放sMICA是腫瘤細胞削弱MICA-NKG2D系統免疫監視的重要途徑[21]。mMICA和sMICA對機體免疫系統的作用方向相反[22]。有文獻報道，干擾素等可上調腫瘤mMICA的表達，且MICA多態性可影響mMICA的表達及sMICA的剪切[23]。TagSNP是疾病尤其是癌癥等復雜疾病關聯研究的重要分析策略。因此，探索MICA多態性尤其是MICA基因TagSNP對CRC的影響十分重要。本課題組前期研究發現，104例CRC癌組織和對應癌旁組織的MICA基因外顯子2～5區無體細胞突變發生[13]。基于此，本研究選擇536例健康對照組的外周血標本進行MICA基因外顯子2～5區的SNP進行研究。本研究發現，CRC組與健康對照組7種MICA基因TagSNP位點的差異有臨界統計學意義(P<0.1)。本課題組將在以后的研究中增加CRC組及健康對照組樣本量進一步研究，使數據更具有說服力。

CRC典型的惡性變過程涉及多種致病因素，如基因突變、表觀遺傳學改變、局部炎癥改變等。早期發現這些致癌因素并做出早期診斷有利于CRC的防治。MICA基因及其受體NKG2D在腫瘤免疫監視及腫瘤細胞殺傷方面有重要作用[24-25]。MICA基因SNP多態性可影響其與NKG2D的識別與結合，進而影響其免疫監視功能。本研究中，MICA外顯子2～5區7種TagSNP在CRC組及健康對照組的差異有臨界統計學意義(P<0.1)，且TagSNP之間強連鎖。說明MICA基因TagSNP具有關聯分析CRC的潛力[26-27]。