基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對調(diào)控畢加索小丑魚（Picasso clownfish）白化體征關(guān)鍵基因的研究

何麗斌 ，黃鎮(zhèn), ，吳水清，鄭樂云

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；3.福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350117)

1 引言

海洋觀賞魚類的體色多彩多樣，是脊椎動(dòng)物最豐富的形態(tài)特征之一，對于動(dòng)物生存、進(jìn)化具有重要的意義。體色及其形狀、紋路等不同色素模式是魚類最直觀的適應(yīng)性狀之一，影響著魚類的聚集、躲避敵害、警告獵食者或競爭者及性選擇，且對魚類的識(shí)別具有重要的意義[1-2]。

小丑魚屬于雀鯛科（Pomacentridae），海葵魚亞科（Amphiprioninae）[3]。小丑魚在世界范圍內(nèi)共有20 多種，是重要的海洋觀賞魚類[4]。其中，畢加索小丑魚是黑背心小丑魚（Amphiprion percula）自交產(chǎn)生的后代中出現(xiàn)的品種[5]，由于其皮膚組織具有不規(guī)則的白色、黃色和黑色斑塊與紋路，因而具有較高的觀賞性與商品價(jià)值。由于黑色或者黃色個(gè)體的皮膚組織發(fā)生白化現(xiàn)象，最后導(dǎo)致其出現(xiàn)不規(guī)則的白色斑塊皮膚。白化的特征表現(xiàn)為皮膚、頭發(fā)和眼睛中缺乏黑色素，是自然界中常見的體色變異[6]。已有研究表明[7]，白化的表型在不同種類的動(dòng)物中受到不同的基因表達(dá)調(diào)控，因此，白化表型產(chǎn)生的分子機(jī)制因物種而異。已有的研究表明[8]，白化現(xiàn)象與溶酶體途徑在遺傳上有關(guān)，并與人類疾病相關(guān)。在漁業(yè)生產(chǎn)中，體色也是一個(gè)重要的價(jià)值特征，例如白化海參的市場價(jià)值明顯高于正常顏色的海參（黑褐色、灰褐色或者黃褐色）[9]。因此，闡明白化產(chǎn)生的分子機(jī)制不僅有益于人體健康，而且為體色育種提供重要線索。

2 材料與方法

2.1 材料采集

實(shí)驗(yàn)用畢加索小丑魚取自福建省水產(chǎn)研究所生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，為同一親本產(chǎn)生的后代。根據(jù)《ARRIVE 2.0 指南》和美國國立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（NIH 出版物編號(hào)8023，1978 年修訂）進(jìn)行動(dòng)物樣品采集工作和實(shí)驗(yàn)方案制定。排除性別差異和體型相似（體長為（35.2±1.5）mm），實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選了9 尾的亞成魚個(gè)體，包括3 尾白化魚、3 尾黃色魚（以下簡稱黃魚）和3 尾黑色魚（以下簡稱黑魚）（圖1a），3 種魚在胸鰭與臀鰭身體兩側(cè)之間相同部位分別呈現(xiàn)白色、黃色、黑色的皮膚組織。在本研究中，將白化樣本編號(hào)為A_1、A_2 和A_3，黃色樣本編號(hào)為Y_1、Y_2 和Y_3，黑色樣本編號(hào)為B_1、B_2 和B_3。實(shí)驗(yàn)剝?nèi)×唆~的皮膚組織后將組織切成小塊并在磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）中洗滌3 次。實(shí)驗(yàn)將每份樣品的皮膚組織均分為兩份，將一份儲(chǔ)存在液氮中備用，另一份用于提取總RNA。

圖1 3 種小丑魚皮膚組織的表型差異以及基因表達(dá)差異Fig.1 Phenotypic differences and gene expression differences in skin tissues from three species of Picasso clownfish

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol 試劑（Invitrogen，加拿大）從皮膚組織中提取總RNA 后通過Agilent 2 100 方法檢測 RNA 樣品純度、濃度和完整性。質(zhì)量控制后，使用oligo（dT）磁珠從每個(gè)樣品的 1 μg 總RNA 中分離帶poly（A）的mRNA，隨后采用超聲處理成隨機(jī)片段。使用TruSeq RNA 文庫制備試劑盒v2（Illumina，美國）構(gòu)建cDNA文庫，基于Illumina HiSeqTM2500 高通量平臺(tái)，以Pair-end 150 bp 雙端測序模式對cDNA 文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.3 序列比對

為了獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，使用SolexaQA 軟件從原始讀數(shù)數(shù)據(jù)中修剪接頭和低質(zhì)量讀數(shù)[10]。以眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)（GenBank:NXFZ00000000.1）為參考基因組，利用HISAT2 軟件，將過濾后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用默認(rèn)參數(shù)與參考基因組進(jìn)行比對。通過Burrows Wheeler（BWA）軟件將過濾后的基因組測序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對[11-12]。

2.4 差異表達(dá)基因分析

使用 Hisat2-build v 21.0[13]軟件構(gòu)建參考基因組的索引，使用HISAT v 2.1.0[13]將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對至參考基因組。基于基因長度計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量（FPKM），并使用StringTie[14]v1.3.5 軟件計(jì)算基因的讀數(shù)計(jì)數(shù)。本研究中的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）分析采用BH 法校正的p值（p＜0.05）為標(biāo)準(zhǔn)閾值。

2.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

以p＜0.05 為閾值，分別使用GOseq R Bioconductor 包和KOBAS 2.0 對差異基因進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析[14-15]。

2.6 qPCR 驗(yàn)證

通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)靶基因（adcy5、akdp7、crabp1、creb3l2、ednrb、flt4、fzd2、gng10、ivns1abp、nkiras1、robo4、ssbp2、tfpi2、wnt11、zdhhc2）的引物（表S1），所設(shè)計(jì)的引物均在不同的外顯子上，在qPCR 檢測中能避免基因組DNA 污染。使用Promega公司的GoScript? Reverse Transcriptase System試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Maxima SYBR Green qPCR Mix（2X）進(jìn)行qRT-PCR，總反應(yīng)體積為20 μL，包括10 μL SYBR qPCR Mix、0.8 μL 正向引物、0.8 μL 反向引物、2 μL cDNA 和6.4 μL 無RNase 的水。PCR 擴(kuò)增程序：95°C 30 s、95°C 5 s、59°C 10 s、72°C 15 s 共40 個(gè)循環(huán)。通過Bio-Rad 公司的iQ5 軟件檢測熒光信號(hào)并計(jì)算熔解溫度。以β-actin 為對照，采用2-ΔΔCt法分析各靶基因的相對表達(dá)量[16]。本實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)錄組測序樣本的所有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)均使用3 個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行基因表達(dá)量驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序

通過樣品取樣、RNA 提取、文庫構(gòu)建和上機(jī)測序，本實(shí)驗(yàn)9 份樣品獲得的原始讀數(shù)數(shù)量在450×104～650×104之間，數(shù)據(jù)質(zhì)控后93%～98%的讀數(shù)為可用讀數(shù)。每個(gè)樣品與參考基因組的比對率均大于75%。通過FPKM 值估計(jì)皮膚組織中基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，所有樣品中基因表達(dá)的分布相似，表明沒有系統(tǒng)性的基因表達(dá)差異。樣本間的相關(guān)系數(shù)結(jié)果顯示，所有樣本都表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，且同一組的樣本表現(xiàn)出更強(qiáng)的相關(guān)性水平，表明每組都有良好的生物學(xué)重復(fù)。

3.2 差異表達(dá)基因的鑒定

本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步比較3 組樣品之間的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量來分析DEGs。結(jié)果顯示，與黃色皮膚樣品相比，白色皮膚樣品中有1 312 個(gè)DEGs，其中包括359 個(gè)上調(diào)基因和953 個(gè)下調(diào)基因（表S2）。與黑色皮膚樣本相比，白色皮膚樣本中總共有1 578 個(gè)DEGs，包括331 個(gè)上調(diào)基因和1 247 個(gè)下調(diào)基因（表S3）。此外，黑色皮膚與黃皮膚樣本相比存在65 個(gè)DEGs，其中9 個(gè)下調(diào)基因，56 個(gè)上調(diào)基因（表S4，圖1b）。基于組間的DEGs，利用基因的表達(dá)值對樣本進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，所有樣品表現(xiàn)出與膚色一致的聚類模式（圖2）。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基于DEGs 比基于全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)有更好的聚類結(jié)果，表明DEGs 能夠反映組間的核心差異。

圖2 基于差異表達(dá)基因?qū)? 種樣本和基因進(jìn)行層次聚類Fig.2 Hierarchical clustering of 3 samples and genes using differentially expressed genes

3.3 差異表達(dá)基因在與黑色素生成相關(guān)的生物過程中的功能作用

為了進(jìn)一步解析畢加索小丑魚白色皮膚中特異性DEGs 的功能，我們對白色和黃色相比（標(biāo)記為Avs-Y）的DEGs、白色和黑色相比（標(biāo)記為A-vs-B）的DEGs 分別進(jìn)行了GO 功能富集和分析（圖3）。結(jié)果顯示，A-vs-Y 和A-vs-B 的差異基因集均在蛋白質(zhì)結(jié)合（如細(xì)胞黏附和趨化因子受體結(jié)合）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（如核轉(zhuǎn)運(yùn)）、蛋白質(zhì)入細(xì)胞核和調(diào)控信號(hào)（如生長調(diào)節(jié)和酶調(diào)節(jié)活性）這些GO 生物學(xué)過程中存在顯著的富集水平（表S5，表S6）。我們也對這些差異基因進(jìn)行了KEGG 通路富集，結(jié)果顯示，存在7 條富集顯著的信號(hào)通路（p＜0.05），包括細(xì)胞外基質(zhì)-受體互作黏著斑、細(xì)胞黏附分子、緊密連接、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、鈣信號(hào)通路和酪氨酸代謝（表S7）。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)許多DEGs 參與Wnt 信號(hào)通路、Hedgehog 信號(hào)通路、苯丙氨酸代謝和黑色素合成通路。雖然這些通路在KEGG 富集分析中不顯著，但它們與色素細(xì)胞分化和皮膚顏色密切相關(guān)。

圖3 基于白色-黃色（A-vs-Y）和白色-黑色（A-vs-B）皮膚組織的組間差異表達(dá)基因生物學(xué)功能富集Fig.3 Biological function enrichment of intergroup differentially expressed genes based on white-yellow (A-vs-Y) and white-black (A-vs-B) skin tissues

我們將黑色與白色皮膚的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相比，發(fā)現(xiàn)在白色皮膚樣品中涉及黑色素生成的基因存在下調(diào)趨勢（例如ednrb、ednra、tyr、mitfa和dct）。結(jié)果顯示，雖然多數(shù)基因表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著下調(diào)，但參與黑色素合成的25 個(gè)基因在白化皮膚中的表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯的降低（圖4）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了在Hedgehog 信號(hào)通路和Wnt 信號(hào)通路中的DEGs（包括wnt9b、wnt5b、wnt11和wnt3a），顯示出從黑色到黃色到白化樣本其表達(dá)水平逐漸降低的現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，這些基因在黃色和白化皮膚組織中的抑制表達(dá)可能會(huì)阻斷信號(hào)傳導(dǎo)過程和下游生物合成途徑（包括黑色素生物合成）。因此，通過多個(gè)信號(hào)通路的基因表達(dá)水平研究表明，畢加索小丑魚的白色皮膚的產(chǎn)生可能是由多個(gè)信號(hào)通路上的異常基因表達(dá)共同引起的。

3.4 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行差異表達(dá)基因驗(yàn)證

為了驗(yàn)證以上分析結(jié)果，我們使用黑色素生物合成通路中5個(gè)核心的DEGs（adcy5、creb3l2、ednrb、fzd2、wnt11）以及在A-vs-Y 和A-vs-B 比較之間隨機(jī)選擇了10 個(gè)DEGs（akap7、crabp1、flt4、gng10、ivns1abp、nkiras1、robo4、ssbp2、tfpi2、zdhhc2）設(shè)計(jì)引物，通過熒光定量PCR 相對定量法檢測這些基因的表達(dá)情況，并與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)行比較。得到的基因表達(dá)量的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序所得結(jié)果趨勢一致（圖5）。5 個(gè)DEGs 的表達(dá)水平（例如ednrb）均顯示出一致的變化趨勢（圖5），證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

圖5 參與黑色素生成的關(guān)鍵功能基因的驗(yàn)證Fig.5 Validation of key functional genes involved in melanin production

4 討論

畢加索小丑魚為黑背心公子小丑魚（Amphiprion percula）的遺傳變異體[5]，以其不規(guī)則的條紋圖案和體色深受廣大消費(fèi)者的喜愛，而在養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的白色皮膚花紋雜亂無章的畢加索小丑魚極為珍貴，但其皮膚產(chǎn)生白色皮膚的遺傳機(jī)制目前仍然未知[5]。已有研究結(jié)果表明[17-18]，關(guān)鍵基因的異常表達(dá)（例如tyr）與白化現(xiàn)象密切相關(guān)。在本研究中，我們對畢加索小丑魚的同一部位，但是不同顏色的皮膚組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，確定了小丑魚不同顏色皮膚組織的DEGs，并分析了白色皮膚組織中DEGs 的生物學(xué)功能。

在3 種皮膚組織兩兩比對的差異基因數(shù)目中，白色與黑色相比的差異基因數(shù)目最多，白色與黃色相比的次之，而黑色與黃色相比的差異基因數(shù)目最少，提示在皮膚組織從黑色到黃色再到白色中，存在許多基因的表達(dá)受到逐層抑制現(xiàn)象。我們對白色與黑色、白色與黃色相比得到的DEGs 進(jìn)行了KEGG 通路的功能富集分析，結(jié)果表明，這些DEGs 參與了細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黑色素生成、Hedgehog 信號(hào)通路和 Wnt 信號(hào)通路的調(diào)控。許多參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用的膜受體的基因（如lama2/3/4、thbs1b/2a/3a/4a、vtna和argn）在白色皮膚組織中表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)（表1）。有研究結(jié)果表明，許多細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用基因可能影響早期色素細(xì)胞增殖或分化，進(jìn)而影響黑色素細(xì)胞對膚色的調(diào)控[19]。Wnt 信號(hào)通路也與黑色素合成有關(guān)，已有研究表明[20]，抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路會(huì)抑制黑色素生成。有研究報(bào)道[21]稱，wnt1在調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的分化方面發(fā)揮重要作用，并且wnt1基因在Wnt 信號(hào)通路和Hedgehog 信號(hào)通路中都起調(diào)控作用，本研究發(fā)現(xiàn)，畢加索小丑魚白色皮膚的wnt1基因表達(dá)量明顯低于黑色皮膚，表明wnt1基因在調(diào)控小丑魚皮膚中的黑色素生成方面發(fā)揮重要作用。

表1 參與 ECM 受體相互作用的基因表達(dá)量Table 1 Expressions for genes involved in the ECM-receptor interactions

我們還分析了其他色素細(xì)胞中涉及基因的表達(dá)水平（包括黃素、紅素、虹色素、白細(xì)胞和氰基），發(fā)現(xiàn)這些基因在黃色和黑色樣本之間存在顯著的表達(dá)差異（表2）。而已有研究顯示[22]，Sox5作為Pax7a的下游基因發(fā)揮作用，控制葉黃素的分化和發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參與葉黃素分化的Sox5基因（表S2，表S3）在白色-黃色和白色-黑色比較中均表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)差異，這可解釋黃色和白化皮膚之間的顏色差異。

表2 參與色素沉積過程的基因表達(dá)量Table 2 Expressions for genes involved in the pigmentation process

續(xù)表 2

有研究顯示[6,10]，黑色素合成中的核心功能基因出現(xiàn)基因突變是導(dǎo)致許多物種白化現(xiàn)象的重要原因。研究結(jié)果顯示，多數(shù)基因在黑色和白化樣本之間表現(xiàn)出差異表達(dá)，并且表現(xiàn)出從黑色到黃色再到白化樣本逐層遞減表達(dá)的現(xiàn)象，并觀察到參與黑色素合成的3 個(gè)核心基因（tyr、tyrp1b和dct）在白色皮膚樣本中均出現(xiàn)基因表達(dá)量急劇下降現(xiàn)象。我們還發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)差異表達(dá)的基因均表現(xiàn)出從黑色到黃色再到白化樣品逐漸降低的表達(dá)，與許多參與黑色素生成的重要基因顯示出一致的表達(dá)模式。如圖4 所示，我們發(fā)現(xiàn)有11 個(gè)基因（ednrba、calm1b、adcy5/9、kitlga、kitb、wnt、fzd2/9a、mitfa、tyr、tyrp1b和dct基因）的表達(dá)水平在黑色樣品中最高，但卻在黃色和白化樣本出現(xiàn)下調(diào)。其中，tyr基因負(fù)責(zé)編碼酪氨酸酶，該酶有研究報(bào)道是黑色素合成的限速酶[23]；tyrp1基因是一種酪氨酸酶相關(guān)蛋白，特異性位于黑色素細(xì)胞中，參與黑色素合成[24]；而kitlga基因是編碼KIT 的配體[25]，在調(diào)節(jié)酪氨酸酶基因家族的轉(zhuǎn)錄和黑色素合成中發(fā)揮作用[26-27]；MITF基因的突變與人類的白化病有關(guān)[28]，并且有研究表明，MITF基因表達(dá)量差異會(huì)影響黑色素合成和黑色素細(xì)胞存活[29]。綜上所述，我們解析了畢加索小丑魚不同顏色皮膚組織的轉(zhuǎn)錄水平差異基因，發(fā)現(xiàn)了一批與黑色素生成密切相關(guān)的基因在白色皮膚組織中表達(dá)量明顯下調(diào)的現(xiàn)象，為研究小丑魚白色皮膚發(fā)生機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)，并為今后人為干擾基因表達(dá)從而達(dá)到調(diào)控小丑魚體色提供理論依據(jù)。

圖4 參與黑色素生成的關(guān)鍵功能基因的表達(dá)Fig.4 Gene expression for key functional genes involved in the melanogenesis

補(bǔ)充材料

表S1 驗(yàn)證黑色素生成關(guān)鍵功能基因表達(dá)的熒光定量PCR 引物

表S2 白化與黃色皮膚之間的差異基因

表S3 白化與黑色皮膚之間的差異基因

表S4 黃色與黑色皮膚之間的差異基因

表S5 白色與黑色皮膚之間的差異基因的功能富集分析結(jié)果

表S6 白色與黃色皮膚之間的差異基因的功能富集分析結(jié)果

表S7 不同皮膚之間的差異基因的信號(hào)通路富集分析結(jié)果

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