葛根素通過調(diào)節(jié)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ減輕布比卡因誘發(fā)的心肌損傷研究*

于 妍，王春愛△，李玉蘭，梁 曦，溫曉輝

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

布比卡因是一種長效酰胺類局麻藥，廣泛應(yīng)用于各種手術(shù)［1］。布比卡因誤入靜脈或過量使用會(huì)帶來明顯的心臟毒性，表現(xiàn)為惡性心律失常、心肌收縮力下降、循環(huán)衰竭甚至心臟驟停［2］。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）是一類多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［3］，廣泛分布于心肌組織，在維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，參與心肌心律失常、細(xì)胞凋亡、心肌肥厚、心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程［4-7］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察葛根素干預(yù)布比卡因致心肌細(xì)胞損傷模型的心肌細(xì)胞CaMKⅡ磷酸化水平、Ca2+濃度、細(xì)胞凋亡率，探討葛根素是否通過調(diào)節(jié)CaMKⅡ減輕布比卡因誘發(fā)的心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar 大鼠40 只，6 月齡，體質(zhì)量250～300 g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK［甘］2019-0002）。大鼠麻醉前禁食8 h，自由飲水，腹腔注射10% 水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行麻醉。大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，左側(cè)股靜脈置入24 G 套管針用于給藥，右側(cè)頸動(dòng)脈置入24 G套管針用于監(jiān)測動(dòng)脈血壓及采集血樣，采用PowerLab系統(tǒng)監(jiān)測血壓和Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.2 布比卡因中毒模型建立參照文獻(xiàn)［7］方法建立布比卡因中毒模型，經(jīng)股靜脈2 min 內(nèi)輸注0.5% 布比卡因10 mg/kg，Ⅱ?qū)?lián)心電圖出現(xiàn)心律失常（頻發(fā)室性早搏、室性心動(dòng)過速、QRS 延長20%）表明模型建立成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組（C 組）、布比卡因中毒模型組（B 組）、葛根素預(yù)防組（P 組）、葛根素治療組（T組），每組10 只。C 組經(jīng)股靜脈輸注0.9% 生理鹽水3 mL/kg，B組股靜脈輸注0.5%布比卡因10 mg/kg，出現(xiàn)心律失常后輸注0.9% 生理鹽水3 mL/kg，P 組股靜脈輸注葛根素3 mL/kg 5 min后輸注0.5%布比卡因10 mg/kg，T組靜脈輸注0.5%布比卡因10 mg/kg，出現(xiàn)心律失常后立即輸注葛根素3 mL/kg。C組在開始輸注生理鹽水的第8 min 及B、T、P 組在開始輸注利多卡因的第8 min，處死大鼠。

1.4 酶聯(lián)免疫吸收測定法（ELISA）組織樣品在PBS 中勻漿后離心獲得上清液，37℃孵育30 min，用酶標(biāo)記劑沖洗、孵育、顯色。反應(yīng)結(jié)束后測量各孔吸光度，估算樣品Ca2+濃度。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）組織樣品勻漿后取上清液，用蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0033）分離總蛋白。蛋白濃度測定后，總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用p-CaMKⅡ一抗（santacruze，批號(hào)：sc-32289）和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：A0208）37℃分別孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法獲得Western blot圖像。用Image J軟件分析靶蛋白條帶灰度。

1.6 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法組織樣本石蠟切片置于二甲苯逐級(jí)脫蠟，乙醇梯度脫水，再蒸餾水清洗。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡獲得圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)各組凋亡細(xì)胞，并計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptosis index，AI）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示。組間多重比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ的蛋白表達(dá)與C 組比較，B 組心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與B 組比較，P組心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），T組心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 4組大鼠心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)（±s）

表1 4組大鼠心肌細(xì)胞鈣離子濃度及p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)（±s）

注：*表示與C組比較，P＜0.05；#表示與B組比較，P＜0.05

組別C組B組P組T組鼠數(shù)10 10 10 10 Ca2+濃度0.38±0.05 0.49±0.01*0.41±0.07#0.45±0.04 p-CaMKⅡ/CaMKⅡ1.00±0.04 1.55±0.02*1.16±0.03#1.32±0.02

圖1 4組大鼠心肌心肌細(xì)胞p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)

2.2 心肌細(xì)胞凋亡凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色，而非凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。與C 組相比，B 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加（P＜0.05）。與B 組比較，P 組凋亡細(xì)胞減少（P＜0.05），T 組的凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，但凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

表2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較（±s） %

表2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較（±s） %

注：*表示與C組比較，P＜0.05；#表示與B組比較，P＜0.05

組別C組B組P組T組鼠數(shù)10 10 10 10凋亡指數(shù)8.53±1.72 19.24±2.81*13.29±1.28#16.47±2.13

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡染色

3 討論

臨床中布比卡因帶來的心臟毒性主要表現(xiàn)為惡性心律失常，而延遲后除極（delaged after depolarization，DAD）和早后除極（early after depolarization，EAD）是引發(fā)心律失常的關(guān)鍵因素［8］。DAD 發(fā)生在動(dòng)作電位的4 相，而EAD 發(fā)生在動(dòng)作電位復(fù)極的2 相或3 相的一次新的除極［9］，Ca2+濃度的變化在該過程中發(fā)揮重要作用。病理?xiàng)l件下，CaMKⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)上RyR2 受體的S2814 位點(diǎn)過度磷酸化，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+大量泄露，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，最終引發(fā)心律失常［10-11］。過量的CaMKⅡ激活后可促進(jìn)線粒體Ca2+增加，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔異常開放，線粒體能量代謝異常，進(jìn)一步誘發(fā)線粒體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［12］。

葛根素為我國傳統(tǒng)中藥葛根的提取成分，主要用于治療心血管系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代分子藥理學(xué)研究表明，葛根素可降低氯仿誘導(dǎo)的昆明小鼠的心顫發(fā)生率，使烏頭堿所致SD大鼠心搏停止閾劑量、室性期前收縮、室顫、室性心動(dòng)過速顯著提升，對(duì)哇巴因致EWG/B 豚鼠同樣適用，表明葛根素適合治療心律失常［13-14］。葛根素還能抑制心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，對(duì)心肌具有保護(hù)作用［15］。

本研究結(jié)果顯示，布比卡因具有促進(jìn)心肌細(xì)胞CaMKⅡ磷酸化，致使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的作用，從而產(chǎn)生心肌毒性。通過靜脈注射葛根素可以逆轉(zhuǎn)布比卡因造成的心肌細(xì)胞鈣超載、凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。且注入布比卡因前預(yù)先靜脈注射葛根素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于注入布比卡因出現(xiàn)心律失常后再靜脈注射葛根素。

可見，布比卡因具有促進(jìn)磷酸化CaMKⅡ蛋白表達(dá)的作用，葛根素減輕布比卡因致心肌細(xì)胞損傷可能與其調(diào)節(jié)CaMKⅡ磷酸化、減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。但因本實(shí)驗(yàn)未設(shè)立相關(guān)蛋白分子激動(dòng)劑和抑制劑組，難以得出因果關(guān)系。這也是今后進(jìn)一步研究的方向。